Desenvolvimento de metodologias eficientes de diagnóstico molecular dos fungos Phyllocista citricarpa e Phyllocista capitalensis

Abstract

Resumo : Diversas ferramentas para a detecção e identificação molecular de espécies vem sendo utilizadas no diagnóstico de fitopatógenos. Uma destas doenças, Mancha Preta dos Citros (MPC, agente causal fungo Phyllosticta citricarpa), é causa de perdas financeiras ao agronegócio citrícola – graças a depreciação visual e queda prematura dos frutos. Entretanto, outro fungo do gênero, P. capitalensis, não é patogênico a citros, mas filogeneticamente relacionado e morfologicamente semelhante, compartilha o mesmo hospedeiro e habita outras lesões similares a da MPC, gerando uma demanda pela distinção entre as duas espécies, dada a existência de barreiras fitossanitárias à primeira. Assim, o presente trabalho visou construir conhecimento sob duas regiões genômicas previamente utilizadas para a detecção de P. citricarpa (GCP) – até então não utilizada em qPCR – e P. capitalensis (GMF) – com problema de especificidade perante a novas espécies descritas dentro do gênero. Buscou-se a obtenção de sequências homólogas tanto a GCP em P. capitalensis quanto a GMF em P. citricarpa, P. brazilianiae, G. mangiferae e P. citribraziliensis. Também sua obtenção a partir de DNA extraído de tecidos foliares de pomares com sintomas de MPC e das próprias linhagens obtidas destes, pelo método de isolamento tradicional. Procedeu-se com a extração de ácidos nucléicos do respectivo material (kit MoBio UltraCleantm Microbial DNA Isolation), amplificação do fragmento GCP e GMF (em condições menos restringentes quando em outras espécies), clonagem no vetor pGEM®-T, avaliação dos transformantes e sequenciamento, ou o sequenciamento direto em alguns casos. Em seguida, foram desenhados e avaliados primers com base nas sequencias obtidas, visando detecção utilizando PCR quantitativa (qPCR) com o sistema TaqMan® para P. citricarpa e uma alteração na PCR convencional para P. capitalensis, com a substituição do primer reverso. Na região GCP foram observados polimorfismos escassos nas diversas linhagens de P. citricarpa, porém não foi encontrada uma região com alta homologia em P. capitalensis através do método utilizado. Esse resultado demonstra a especificidade destes primers para a espécie P. citricarpa o que diminui o risco de falsos positivos. Foi observada a amplificação de produtos diversos quando utilizado o material extraído diretamente de folhas cítricas, provavelmente associados a artefatos na reação de PCR, que justificam a tentativa de aperfeiçoamento da detecção, visando mais especificidade e sensibilidade. O ensaio de qPCR proposto mostrou-se mais específico entretanto menos sensível que o previamente disponível na literatura. Para a região GMF foram, igualmente, observados polimorfismos escassos nas linhagens de P. capitalensis e não foi encontrado um homólogo em P. citricarpa e P. citribraziliensis através do método utilizado. Tal ausência reforça a especificidade destes primers para P. capitalensis e diminui a possibilidade de falsos positivos para P. citricarpa. O diagnóstico via PCR convencional proposto foi capaz de distinguir o fungo P. capitalensis de todos os demais avaliados. Com o obtido pode-se concluir que os primers propostos para a detecção através de qPCR de P. citricarpa são uma alternativa aos previamente disponíveis e que a alteração no ensaio de detecção de P. capitalensis deixou o mesmo mais específico.