Otimização da expressão e purificação das proteínas recombinantes His-Amtb e do complexo His-DraT/GlnB de Azospirillum brasiliense

Abstract

Resumo : Em Azospirillum brasilense, o metabolismo do nitrogênio tem a proteína integral de membrana AmtB como molécula chave na absorção e percepção dos níveis de amônia do ambiente extracelular. Essa proteína é membro da família Amt/MEP/Rh de proteínas transportadoras de amônia, encontradas em arquea, eubactérias, fungos, plantas e animais. Em A. brasilense, a limitação de amônia seguida de disponibilidade repentina no meio extracelular leva a proteína AmtB a formar um complexo com as proteínas da família PII (GlnB e GlnZ). As proteínas PII são encontradas em quase todos os procariotos e plantas, são homotriméricas e participam na percepção de carbono, nitrogênio e energia. Em altos níveis de glutamina intracelular, cada monômero de PII pode ser uridililado de maneira reversível. Quando as proteínas PII estão em seu estado desuridililado, a formação do complexo Amt-PII é favorecida. A formação deste complexo também responde aos níveis de ATP/ADP e 2-oxoglutarato, sendo estabilizado por ADP. A regulação da atividade da nitrogenase, enzima responsável pela fixação biológica do nitrogênio, é auxiliada pelo sistema DraT e DraG. A enzima DraG ativa a nitrogenase removendo ADP-ribosil da subunidade NifH e DraT inativa a nitrogenase adicionando ADP-ribosil a NifH. As proteínas PII estão envolvidas na regulação das enzimas DraG e DraT. Em resposta a um choque de amônio, a proteína GlnZ interage com DraG possibilitando o carreamento de DraG para a membrana formando um complexo ternário AmtB-GlnZ-DraG que resulta na inativação de DraG. Concomitantemente, GlnB desuridililada interage com DraT, ativando a ADP-ribosilação da nitrogenase. As proteínas AmtB, DraT e GlnB vêm sendo purificadas e estudadas in vitro, no entanto, existem muitos eventos a serem melhor compreendidos no processo de fixação biológica de nitrogênio. No presente trabalho foi realizada, em sistema procarioto de purificação, a otimização da expressão e purificação da proteína HisAmtB de Azospirillum brasilense. Também se trabalhou com o intuito de se obter ótima expressão do complexo His-DraT-GlnB para purificação em condições que possibilitem, futuramente, a sua cristalização.