Construção e expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab de Azospirillum brasiliense

Abstract

Resumo : A fixação biológica de nitrogênio é fundamental para disponibilizar este elemento em uma forma que seja metabolicamente utilizável pela maioria dos organismos. Nas bactérias diazotróficas, que são capazes de fixar nitrogênio, a transcrição dos genes envolvidos neste processo é ativada pela proteína NifA, que tem sua atividade controlada pelos níveis de amônio e oxigênio. Em Azotobacter vinelandii, os genes nifLA estão agrupados em um operon; a proteína NifA tem atividade constitutiva, mas é inativada por NifL em altas concentrações de amônio e/ou oxigênio. Por outro lado, em Azospirillum brasilense, apenas o gene que codifica para a proteína NifA está presente e, neste caso, a própria proteína NifA responde às alterações dos níveis de amônio e oxigênio, através de um mecanismo que envolve sua auto-inibição via o domínio N-terminal. A proteína NifA de A. brasilense é composta por três domínios separados por duas regiões interdomínios. O domínio N-terminal está relacionado com o controle da atividade da proteína por amônio enquanto que a sensibilidade ao oxigênio está relacionada ao interdomínio que conecta o domínio central ao domínio C-terminal. O domínio central é responsável pela interação com a RNA polimerase e ativação da transcrição, enquanto o domínio C-terminal interage com seqüências específicas de DNA. Para estudar o mecanismo de regulação da atividade da proteína NifA de A. brasilense e obter uma proteína NifA insensível aos níveis de amônio foram construídos dois genes quiméricos: nifAQ1Ab, que codifica o domínio N-terminal da proteína NifA de A. brasilense ligado ao domínio central + C-terminal da proteína NifA de A. vinelandii, e nifAQ2Ab, que codifica o domínio N-terminal da proteína NifA de A. vinelandii ligado ao domínio central + C-terminal da proteína NifA de A. brasilense. Fragmentos de DNA contendo as regiões de interesse foram obtidos por reação de PCR utilizando DNA genômino de A. brasilense e um plasmídeo contendo o gene nifA de A. vinelandii como moldes. Os produtos de PCR foram clonados separadamente no vetor pCR2.1. Após confirmação das seqüências de DNA clonadas, os insertos foram clivados com HindIII e XbaI e ligados no vetor pDK7. Em seguida, os genes quiméricos foram montados no vetor de expressão pET28a, unindo as regiões que correspondem aos domínios N-terminal de A. brasilense e central + C-terminal de A. vinelandii ou aos domínios N-terminal de A. vinelandii e central + C-terminal de A. brasilense. A partir da montagem dos genes quiméricos no vetor pET28a foi possível fazer a expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab em E. coli e determinar as melhores condições para sua solubilização. Os genes quiméricos foram construídos com sucesso e a expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab revelou a alta insolubilidade dessa proteína. Os ensaios de expressão mostraram que as melhores condições de expressão foram obtidas após indução a 37ºC a partir de 2 horas ou a 18ºC durante a noite, utilizando IPTG 0,5mmol/L ou lactose 0,5% como indutores.