Construção de bioferramentas para o estudo e expressão da proteína QSOX em células eucarióticas

Abstract

Resumo : Sulfidril Oxidases s„o enzimas que possivelmente participam da formaÁ„o de pontes dissulfeto e dobramento oxidativo de v·rias proteÌnas. Um membro desta famÌlia de sulfidril oxidases È a Quiescina/sulfidril oxidase (QSOX). O gene das enzimas QSOX È amplamente distribuÌdo em eucariotos, e j· foi descrito em protistas, plantas e metazo·rios, n„o sendo encontrado em fungos. Estudos demonstram que estas enzimas s„o encontradas extracelularmente em tipos celulares associados com vias secretoras. O destino extracelular de QSOX sugere que esta possa estar envolvida na remodelaÁ„o dos componentes da matriz extracelular ou na sua sinalizaÁ„o celular principalmente pelo favorecimento da formaÁ„o de pontes dissulfeto, que s„o requeridas para o apropriado dobramento, funÁ„o e estabilidades protÈicas. Em humanos foram descritos dois genes para estas enzimas; QSOX1 (Q6) e QSOX2 (QSOXN) que s„o encontrados em cromossomos distintos. QSOX1 È consideravelmente mais abundante nos tecidos de mamÌferos que QSOX2. QSOX1 possui duas isoformas; um transcrito longo (QSOX V1) e um transcrito curto (QSOX V2).Embora na literatura existam muitos estudos sobre QSOX, ainda n„o se sabe suas reais funÁies e a regulaÁ„o da express„o desta proteÌna. Nosso objetivo foi a produÁ„o de ferramentas que venham a auxiliar em seu estudo, com a construÁ„o de vetores para a express„o de QSOX em cÈlulas de mamÌferos. Para produÁ„o destas ferramentas utilizamos dois vetores (pcDNA 3.1 (-) e pSECTag2/Hygro), para que fosse possÌvel a express„o da proteÌna QSOX em cÈlulas de mamÌferos e assim estudar e entender melhor sua funcionalidade. Para a amplificaÁ„o das variantes V1 e V2 foi necess·rio o desenho de iniciadores e assim produzir os insertos para construÁ„o dos vetores. AtravÈs da utilizaÁ„o das tÈcnicas de clonagem gÍnica construÌmos os vetores que foram submetidos a reaÁies de sequenciamento de bases para analise da integridade dos insertos. Por fim, um dos vetores obtidos foi utilizado para transfecÁ„o em cÈlulas HEK 293T e a express„o da proteÌna QSOX V2 nestas cÈlulas foi verificada atravÈs de ensaio de ìWestern Blottingî com anticorpo anti-QSOX. Contudo, n„o foi possÌvel detectar a proteÌna recombinante nestas