Construção de vetores para identificação de ligantes de semaforinas classe 5 através do sistema de duplo-híbrido

Abstract

Resumo : Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, os neurônios devem fazer contato correto com alvos específicos que normalmente estão muito afastados. Para isso são necessárias vias sinalizadoras que funcionam como guias no correto direcionamento do cone de crescimento do axônio. Tais vias sinalizadoras são constituídas por moléculas que atraem o axônio para o seu alvo e ao mesmo tempo o repele de vias inapropriadas. Dentre estas moléculas, as semaforinas (Semas) pertencem a uma grande família de proteínas secretadas ou associadas à membrana, envolvidas na navegação axonal, fasciculação, ramificação e formação de sinapses, além da participação na progressão tumoral, angiogênese e diferenciação de linfócitos B. As semaforinas de classe 5 são proteínas transmembrânicas, que contém sete repetições trombospondinas. Dois membros dessa família foram identificados em vertebrados, Sema5A e Sema5B. Na literatura há poucos estudos sobre essa classe específica, especialmente sobre Sema5B. Muitas questões sobre esta molécula permanecem em aberto, tais como sua modulação, expressão celular e papéis específicos. O trabalho em questão teve como objetivo construir vetores para expressão dos domínios citoplasmáticos das Semaforinas 5A e 5B (Sema_5A e Sema_5B) em leveduras, ferramentas que, posteriormente, serão utilizadas para identificar os parceiros moleculares desses domínios através do sistema de duplo-híbrido em leveduras. Essa metodologia é amplamente utilizada para detectar interações protéicas in vivo e será de grande importância para o desenvolvimento de projetos futuros e de muitas colaborações. Para as construções, fragmentos de DNA contendo as seqüências codificadoras dos domínios citoplasmáticos de Sema5A e Sema5B (Sema_5A e Sema_5B) foram amplificados por PCR, digeridos e inseridos no vetor pGILDA. Estas construções foram transformadas em bactérias DH5a. As colônias que apresentavam o inserto, observados através de PCR de colônia, seguiram para repique, porém nenhum crescimento posterior foi observado. Dessa forma, verifica-se a necessidade de reconstruir o vetor com os insertos de interesse para o prosseguimento do trabalho. Essas construções constituem ferramentas úteis para a identificação de proteínas ligantes de semaforinas de classe 5 e podem nos trazer pistas valiosas sobre a participação destas proteínas em processos fisiológicos e patológicos, como desenvolvimento e regeneração do sistema nervoso central.