Desenvolvimento e validação interlaboratorial de um protocolo aplicado para a detecção de Toxocara sp. e Ascaris sp. em morangos

Abstract

Resumo: As doenças de transmissão hídrica e alimentar (DTHA) são um desafio global, acarre tando custos bilionários ao Sul Global. No entanto, há escassez de dados sobre o tema, especi almente relacionadas às parasitoses. O morango é a fruta vermelha mais consumida no Brasil, com produção superior a 187.000 toneladas em 2023. Essa fruta é geralmente consumida crua e os processos de higienização padrão são ineficientes para eliminar ou inativar ovos de hel mintos. Além disso, inexiste método padrão para a identificação desses ovos nessa fruta. O objetivo deste estudo foi padronizar um protocolo e aferir a sensibilidade de detecção de ovos de helmintos em morangos contaminados artificialmente com ovos de Toxocara canis e Ascaris suum. Complementarmente, objetivamos validar o protocolo interlaboratorialmente, em dife rentes estados do Brasil e, aferir a presença de contaminação natural por parasitos em morangos orgânicos comercializados em feiras de Curitiba/PR. Foram utilizadas duas doses de ovos de T. canis (33 e 103) e A. suum (71 e 139) para a padronização. Para tal, 6 protocolos por mo delo/dose foram analisados em triplicata (n=72 ensaios), mais 1 ensaio controle-negativo por protocolo (n=24). Após contaminação, os morangos foram submetidos a duas estratégias de lavagens (agitação manual e pincelamento) e duas variáveis foram analisadas: solução de dis sociação (Glicina 1M pH 5,5; Alconox® 0,1% ou Tween® 20 0,1%) e temperatura da solução (ambiente ou 37 °C). Os protocolos tiveram como etapas comuns a sedimentação do líquido, seguido de centrifugação e leitura total por microscopia óptica do sedimento obtido. Sete labo ratórios participaram do processo de intervalidação, executando o protocolo padronizado em triplicata com ovos de T. canis (dose de 142 ovos). Na etapa de aferição de contaminação na tural, foram analisados 267 morangos (2,91kg), representando 50 pool e montante de 6,02kg de morangos obtidos. Para ensaios utilizando ovos de T. canis, o Protocolo 3 (solução aquecida de Alconox®) apresentou a melhor taxa de recuperação média de ovos, 79,80% e 81,55%, para as doses 1 e 2, respectivamente. Para a dose 1 de A. suum, o Protocolo 3 apresentou a maior taxa de recuperação (46,48%). Entretanto, para a dose 2, o Protocolo 1 (solução aquecida de Glicina) apresentou melhor desempenho (36,69%), apresentando diferença de pouco mais de 1% para o Protocolo 3 (35,49%). O Protocolo 3 foi escolhido para intervalidação e aferição de contami nação natural. Para os ensaios da validação interlaboratorial, as taxas de recuperação de ovos variaram de 15,73% a 76,74%, com média de 52,45%. Com relação à ocorrência natural de parasitos em morangos orgânicos, 4,00% (2/50) dos pool apresentaram contaminação (Ascaris sp. e Toxocara sp.). A aferição do desempenho da técnica por outros laboratórios, bem como a detecção de contaminação na etapa de comercialização, adicionam robustez ao protocolo pa dronizado, contribuindo para os setores de vigilância epidemiológica, sanitária e controle de qualidade, visto que inexiste para essa fruta método padronizado para aferição da sanidade pa rasitológica. Ademais, demonstra risco potencial de aquisição de parasitoses mediante ingestão crua da fruta, enfatizando a necessidade de monitoramento da qualidade higiênico-sanitária e adoção de medidas de controle

Abstract: Water- and Foodborne Diseases (WFD) are a global public health issue, resulting in billion-dollar costs for the Global South. However, research on the topic is sparse, especially regarding parasitic diseases. Strawberry is the most consumed berry in Brazil, with over 187.000 tons produced in 2023. This fruit is often consumed raw or with inadequate hygiene methods that may fail to remove or inactivate parasites. Furthermore, there is no standard pro tocol for the identification of nematode eggs in this fruit. The main goal of the present study was to develop, standardize and validate a protocol for the detection of helminth eggs in straw berries, for further evaluation of this fruit sold in organic open markets in Curitiba, Paraná, Brazil. The standardization via artificial contamination assays were performed with two known doses of Toxocara canis eggs (33 and 103) and Ascaris suum eggs (71 and 139). To estimate the sensitivity recovery rate, 6 protocols per model/dose were analyzed in triplicate (n=72 es says), plus 1 negative-control essay per protocol (n=24). The contaminated strawberries were subjected to two washing procedures (manual agitation and brushing), and two variables were analyzed: dissociation solution (Glycine 1M pH 5.5, Alconox 0.1%, or Tween 20 0.1%) and solution temperature (room temperature or heated at 37 °C). All protocols included a common step of sedimentation of the liquid from the two washing procedures separately, followed by centrifugation and microscopic examination of the entire pellets obtained. Seven laboratories participated in the intervalidation process, performing the standardized protocol in triplicate with T. canis eggs (dose = 142 eggs). In the stage of evaluation of natural contamination, a total of 267 units (± 2.91 kg) of organic strawberries were divided into 50 pool for analysis, repre senting 6.02 kg total obtained. Toxocara canis experiments showed that Protocol 3 (heated Al conox solution) removed 79.80% and 81.55% of spiked eggs for dose 1 and 2, respectively. Ascaris suum dose 1 presented Protocol 3 with the highest mean recovery rate (46.48%). How ever, on dose 2, Protocol 1 (heated Glycine solution) performed better (36.69%), showing a difference of just over 1% for Protocol 3 (35.49%). Protocol 3 was elected to search for hel minth contamination at commercialization stage, where 4.00% (2/50) of pool harbored Ascaris sp. eggs. Interlaboratorial validation showed recovery rates ranging from 15.73% to 76.74% (mean=52.45%). The measurement of the technique performance by other laboratories, as well as the detection of contamination at the marketing stage, further strengthens the standardized method, showing that the protocol may contribute to the sanitary and epidemiological surveil lance and quality control sectors, since there is no standardized method for parasitological as sessment in strawberries. Moreover, this study highlights the potential risk of acquiring para sites through the ingestion of this raw fruit, emphasizing the need to monitor hygienic-sanitary quality and adopt control measures