Mobilização de polihidroxibutirato (PHB) e análise da expressão das PHB despolimerases, PhaZs1 e PhaZs2, em Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo: A ß-proteobactéria Herbaspirillum seropedicae é uma espécie endofítica que se associa com plantas de interesse agrícola, promovendo o crescimento vegetal. Além disso, essa bactéria sintetiza polihidroxibutirato (PHB), um biopolímero armazenado dentro da célula em forma de grânulos insolúveis. O PHB é sintetizado a partir de três reações: (1) condensação de duas moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil CoA, catalisada pela ß-cetoacil-CoA tiolase; (2) redução do acetoacetil-CoA a 3 hidroxibutiril-CoA, catalisada pela acetoacetil-CoA redutase, com consumo de NADPH; e (3) polimerização do 3-hidroxibutiril-CoA pela PHB sintase, resultando no acúmulo de PHB. Quando as fontes externas de carbono se tornam limitadas, o PHB é mobilizado por PHB despolimerases (PhaZs). Em H. seropedicae, há dois genes que codificam essas enzimas: phaZ1 e phaZ2 e, neste trabalho analisamos o papel dessas PHB despolimerases no metabolismo de PHB em H. seropedicae. Ensaios realizados com mutantes nos genes phaZ1 e phaZ2 mostraram que a deleção de phaZ1 (DeltaphaZ1) resulta em taxas de degradação de PHB menores que SmR1 e DeltaphaZ2, evidenciando a importância dessa despolimerase indicando que PhaZ1 é a principal enzima envolvida na mobilização de PHB, especialmente em cultivos com altas concentrações de íons amônio, com a degradação ocorrendo a partir da fase estacionária. Por outro lado, se as estirpes são cultivadas sob condições limitantes de amônio, o PHB não é degradado, mas é progressivamente sintetizado, resultando em concentrações superiores a 40% do peso seco celular na estirpe selvagem SmR1. A despolimerase PhaZ2 é fundamental para o acúmulo de concentrações mais elevadas de PHB, uma vez que os mutantes DeltaphaZ2 e DeltaphaZ1DeltaphaZ2 acumularam 10% menos PHB que a estirpe SmR1 e o mutante DeltaphaZ1. Nessas condições, os grânulos são morfologicamente maiores, apresentando interferência sobre as leituras de densidade óptica (DO600) das culturas, consequentemente influenciando a avaliação do crescimento bacteriano. As análises de expressão gênica revelam que a expressão de phaZ1 é dependente da presença de grânulos de PHB e de altas concentrações de íons NH4+. No mutante DeltaphaC1, a expressão de phaZ1 é reprimida por PhaR. No entanto, mesmo com a formação de grânulos, se não houver NH4+ disponível, phaZ1 também é reprimido. Em oposição, a expressão de phaZ2 ocorre em condições de limitação de nitrogênio sendo dependente dos fatores transcricionais NtrC e RpoN

Abstract: The endophytic ß-proteobacterium Herbaspirillum seropedicae associates with economically important crops, promoting plant growth. Additionally, this bacterium synthesizes polyhydroxybutyrate (PHB), a biopolymer stored inside the cell as insoluble granules. PHB is synthesized through the following reactions: (1) the condensation of two acetyl-CoA molecules to form acetoacetyl-CoA, catalyzed by ß ketothiolase; (2) the reduction of acetoacetyl-CoA to 3-hydroxybutyryl-CoA, catalyzed by acetoacetyl-CoA reductase, with NADPH consumption; and (3) the polymerization of 3-hydroxybutyryl-CoA by PHB synthase, resulting in PHB accumulation. When external carbon sources become limited, PHB is mobilized by PHB depolymerases (PhaZs). In H. seropedicae, two genes encode these enzymes: phaZ1 and phaZ2. In this work we analysed the role of these PHB depolymerases in the H. seropedicae metabolism. Mutants with phaZ1 deletion showed lower PHB degradation rates than the wild type strain SmR1 and mutant ?phaZ2, highlighting the importance of this PHB depolymerase. Indicating that PhaZ1 is the main enzyme involved in PHB mobilization, especially under growth with high ammonium ion concentrations, with degradation occurring from the stationary phase. In contrast, when the strains are cultivated under ammonium-limiting conditions, PHB is not degraded and is progressively synthesized, resulting in concentrations exceeding 40% of the cell dry weight in SmR1. Furthermore, the PhaZ2 depolymerase is essential for the accumulation of higher PHB concentrations, as the DeltaphaZ2 and DeltaphaZ1DeltaphaZ2 mutants accumulated 10% less PHB than the SmR1 strain and the DeltaphaZ1. Under these conditions, the granules are morphologically larger, interfering with the optical density (OD600) measurements of the cultures, which in turn impact the evaluation of bacterial growth. Gene expression analyses reveal that phaZ1 expression depends on the presence of PHB granules and high concentrations of NH4+ ions. In the DeltaphaC1 mutant, phaZ1 expression is repressed by PhaR. However, even with granule formation, if NH4+ is unavailable, phaZ1 is also repressed. In contrast, phaZ2 expression occurs under nitrogen-limiting conditions and depends on the transcriptional factors NtrC and RpoN