Desenvolvimento de imunossensor eletroquímico impresso em 3D para detecção de antígeno e anticorpo de dengue

Abstract

Resumo: O presente trabalho envolve o desenvolvimento de um imunossensor eletroquímico multiplex impresso em 3D para detecção de proteína não estrutural 1 (NS1 DENV-1) e anticorpos contra a proteína não estrutural 1 (Ab DENV-1) da Dengue sorotipo 1. Para isso foram confeccionadas celas eletroquímicas, impressas com filamento de acrilonitrila butadieno estireno (ABS), que comportassem seis eletrodos de trabalho, um eletrodo de referência e um contra eletrodo. Os eletrodos empregados foram preparados empregando uma impressora 3D a partir de um filamento condutor comercial composto de ácido polilático (PLA) e negro de fumo (elemento condutor). Antes de serem usados, os eletrodos passaram por tratamento em solução de NaOH, com condição otimizada de 1,0 mol L-1 a 60 °C por 30 min, a fim de expor o elemento condutor. Posteriormente, para melhorar o desempenho do eletrodo em tampão fosfato (PBS) pH 7,4 e também a incorporação de proteínas em sua superfície, foi realizada a modificação dos eletrodos com óxido de grafeno, o qual foi eletroquimicamente reduzido (ErGO). Esse processo foi realizado com aplicação de 1,8 V (vs. Eletrodo impresso com filamento condutor) por 30 s de 1,0 mL de uma dispersão de óxido de grafeno 0,12 mg mL-1 diluído 1:1 em KCl 0,1 mol L-1 pH 3,0. Para a construção do imunossensor foi depositado na superfície dos eletrodos de trabalho um volume de 10 uL de uma dispersão de nanopartículas de polihidroxibutirato (PHB) (3,0 ug mL-1) decoradas previamente com elemento de reconhecimento (NS1 DENV-1, 1,0 ug mL-1, ou Ab DENV-1 ,1,5 ug mL-1) e agente bloqueador (BSA, 0,1 mg mL-1), deixado para secar a 37 °C por cerca de 20 min. Os dispositivos foram avaliados separadamente para avaliar a montagem e verificar a viabilidade da detecção dos alvos empregando uma sonda redox [Fe(CN)6]3-/4-. Para isso foram utilizadas medidas de voltametria de onda quadrada (SWV) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). A avaliação foi feita empregando uma estratégia label free com base nos perfis de resposta do sensor depois da construção (controle) e após incubação na presença do alvo em solução contento íons [Fe(CN)6]3-/4-. Foram construídas curvas analíticas para verificar a relação entre concentração e sinal eletroquímico para ambos os alvos investigados (antígenos e anticorpos). Para detecção de anticorpos foram observadas respostas para concentrações maiores que 10 ng mL-1 para ambas as técnicas. Já para a detecção de antígenos foram observadas respostas para concentrações acima de 10 ng mL-1 para EIS e 20 ng mL-1 para SWV. A seletividade do dispositivo frente a Febre Amarela e Chikungunya foi investigada e não sendo observadas interferências significativas. O efeito de matriz em amostras diluídas de soro comercial negativo e fortificado com os alvos também foi avaliado, não sendo observados efeitos de matriz significativos. Após avaliar viabilidade dos sensores de forma isolado, os sensores foram combinados em um mesmo dispositivo e foi possível detectar os alvos de forma sequencial sem interferências significativas em amostras de soro comercial negativo diluído em tampão PBS pH 7,4, soro comercial fortificado com NS1 DENV-1 e soro comercial fortificado com Ab DENV-1

Abstract: This study presents the development of a 3D-printed multiplex electrochemical immunosensor for detecting non-structural protein 1 (NS1 DENV-1) and antibodies against NS1 (Ab DENV-1) of Dengue serotype 1. To achieve this, electrochemical cells were fabricated using acrylonitrile butadiene styrene (ABS) filament, designed to accommodate six working electrodes, one pseudo-reference electrode, and one counter electrode. The electrodes were 3D-printed using a commercial conductive filament composed of polylactic acid (PLA) and carbon black. Before use, they underwent a NaOH treatment under optimized conditions (1.0 mol L?¹ at 60 °C for 30 minutes) to expose the conductive element. To further enhance electrode performance in phosphate-buffered saline (PBS) at pH 7.4 and improve protein incorporation onto its surface, the electrodes were modified with graphene oxide, which was electrochemically reduced (ErGO). This process involved applying -1.8 V (vs. printed electrode with conductive filament) for 30 seconds in 1.0 mL of a 0.12 mg mL?¹ graphene oxide dispersion diluted 1:1 in 0.1 mol L?¹ KCl at pH 3.0. For immunosensor construction, 10 µL of a polyhydroxybutyrate (PHB) nanoparticle dispersion (3.0 µg mL?¹) was deposited onto the working electrode surfaces. These nanoparticles had been previously functionalized with the recognition element (NS1 DENV-1, 1.0 µg mL?¹, or Ab DENV-1, 1.5 µg mL?¹) and a blocking agent (BSA, 0.1 mg mL?¹). The electrodes were then dried at 37 °C for approximately 20 minutes. The sensors were individually tested to assess their assembly and verify their ability to detect target molecules using a redox probe, [Fe(CN)6]³?/4?. Square wave voltammetry (SWV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were used for characterization. A label-free detection strategy was employed, comparing sensor response profiles before and after incubation with the target in a solution containing [Fe(CN)6]³?/4? ions. Analytical curves were constructed to establish the correlation between concentration and electrochemical signal for both antigens and antibodies. For antibody detection, both techniques (SWV and EIS) showed responses for concentrations above 10 ng mL?¹. For antigen detection, responses were observed at concentrations above 10 ng mL?¹ using EIS and 20 ng mL?¹ using SWV. The sensor's selectivity was evaluated against Yellow Fever and Chikungunya, with no significant interference observed. Additionally, the potential matrix effect was assessed using diluted commercial negative serum samples, both unspiked and spiked with the target analytes, revealing no significant matrix interferences. After confirming the viability of the individual sensors, they were integrated into a single multiplexed device. This allowed for the sequential detection of both targets in diluted commercial negative serum, as well as in serum samples fortified with NS1 DENV-1 or Ab DENV-1, without significant cross reactivity or interference