Construção e caracterização bioquímica e fisiológica de estirpes de Azospirillum brasilense super-excretoras de íons amônio

Abstract

Resumo: O melhoramento da capacidade de liberação de nitrogênio fixado por bactérias diazotróficas que se associam naturalmente a diversas gramíneas de interesse comercial, como Azospirillum brasilense, representa uma solução a curto prazo para a crise do nitrogênio, causada pelo uso excessivo de fertilizantes químicos nitrogenados nas lavouras. Entretanto, devido ao alto custo energético para a célula, os processos de fixação e assimilação de nitrogênio nesse organismo são altamente controlados por vias regulatórias que asseguram que o nitrogênio fixado seja prontamente assimilado em biomassa ao invés de ser excretado para o ambiente. Com o intuito de atenuar esses circuitos regulatórios, neste estudo foi realizada a mutagênese do regulador central da transcrição dos genes nif, NifA, através da inserção de mutações pontuais e deleções de trechos específicos em seu domínio regulatório GAF e Q-linker, os quais parecem ser importantes para a formação do complexo inativo da proteína em resposta aos níveis de amônio. Realizou-se também a deleção do gene draT, que codifica para a enzima dinitrogenase redutase ADP-ribosiltransferase, responsável por fazer a modificação pós-traducional da proteína NifH através da adição de um grupo ADP-ribosil, inativando-a sob altos níveis de amônio. Da mesma forma, foi feita a alteração da enzima glutamina sintetase (GS) envolvida nas vias de assimilação de amônio, através da inserção da mutação pontual P347L; a deleção do domínio N-terminal com atividade adenilil-removase da proteína bifuncional de modificação póstraducional GlnE, que regula a atividade de GS; e a introdução de mutações inativadoras no domínio com atividade uridilil-removase de GlnD, responsável por fazer a integração de sinais metabólicos que levam ao controle da atividade de GS através da adenililação de seus monômeros. Os resultados mostraram que a alteração da cascata de sinalização por glutamina através da modificação das atividades AR e UR de GlnE e GlnD, respectivamente, ou da adição da substituição P347L, permitiu a detecção de atividade de nitrogenase constitutiva e excreção de quantidades de amônio a níveis milimolares. Adicionalmente, a incorporação de mutações pontuais em NifA gerou variantes menos responsivas à disponibilidade de nitrogênio e/ou PII, e, quando inseridas no genoma das estirpes excretoras, permitiu a expressão não regulada de transcritos de nifH em condições de suficiência de amônio, maximizando a atividade da nitrogenase. Esses resultados em conjunto sugerem que a geração de estirpes excretoras de A. brasilense requer a falha de sinalização por glutamina, que por sua vez ocasiona o desacoplamento dos processos de fixação e assimilação de nitrogênio.

Abstract: Engineering naturally occurring plant-associated diazotrophs to release fixed nitrogen, such as Azospirillum brasilense, represents a short-term solution to the nitrogen crisis, caused by the excessive use of chemical nitrogen fertiliser in crop cultivation. However, due to its high energy cost to the cell, the nitrogen fixation and assimilation processes in this organism are highly controlled by regulatory pathways which ensure that fixed nitrogen is readily assimilated into biomass rather than being excreted to the environment. In order to mitigate these regulatory circuits, this study aimed to mutagenize the master regulator of n if genes transcription, NifA, through the insertion of point mutations and deletions of specific regions in its regulatory GAF domain and Q-linker, which appear to be important for the inactive protein complex formation in response to ammonium levels. Additionally, in order to relieve the post-translational regulation of the nitrogenase complex under high levels of ammonium, the draT gene was also deleted, which encodes the ADP-ribosyltransferase dinitrogenase reductase enzyme, responsible for modifying the NifH protein through the addition of an ADP-ribosyl group, leading to its inactivation. Similarly, the glutamine synthetase (GS) enzyme involved in ammonium assimilation pathways was altered through the insertion of the point mutation P347L, and the bifunctional post-translational modification proteins GlnE and GlnD, responsible for integrating metabolic signals that lead to GS activity shutdown through the adenylylation of its monomers, were modified by the deletion of the N-terminal adenylylremoving domain of GlnE and the introduction of inactivating substitutions in the uridylylremoving domain of GlnD. The results showed that altering the glutamine signaling cascade by modifying the AR and UR activities of GlnE and GlnD, respectively, or by adding the P347L substitution to GS, allowed the detection of constitutive nitrogenase activity and excretion of millimolar levels of ammonium. Furthermore, the incorporation of point mutations in NifA generated variants less responsive to nitrogen and/or PII availability, and, when inserted into the genome of ammonium-excreting strains, yielded unregulated expression of nifH transcripts under non-nitrogen fixing conditions, maximizing the nitrogenase activity. These results taken together suggest that the construction of A. brasilense excretory strains requires failure of glutamine signaling, which in turn causes the uncoupling of the nitrogen fixation and assimilation processes.