Soluções a base de cobre (CU-II) para o controle de endo e ectoparasitos de ruminantes

Abstract

Resumo: O principal problema de saúde na pecuária é a presença de infecções por parasitos, sendo a principal causa da diminuição do bem-estar e perda de produtividade em ovinos e bovinos. Dada a grande dificuldade com o controle de parasitos em ruminantes, o objetivo deste trabalho foi demonstrar a eficácia de soluções à base de cobre (cloreto e sulfato de Cu-II) contra nematodas gastrintestinais (NGI) e o carrapato Rhipicephalus microplus, utilizando uma série de experimentos in vitro. Nas coproculturas de ovinos e bovinos, foram identificadas larvas de Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Ostertagia sp., Oesophagostomum sp. e Cooperia spp. Para os NGI, foram utilizados os testes de eclodibilidade de ovos (TEO) e desenvolvimento larvar (TDL), e o teste de inibição da migração larvar (TIML) foi utilizado para os NGI com soluções de Cu-II. O TIML ainda foi utilizado para testar a combinação das soluções de Cu-II com nitroxinil 34% (NTX). O NTX foi escolhido por já ter sido usado na rotina com os animais deste estudo. O teste de imersão em adultos (TIA) foi utilizado para o R. microplus. Para os NGI, os testes foram realizados para verificar a eficácia das soluções isoladas nas concentrações de 2,0, 7,0, 30, 125, 500 e 2000 µM, e o resultado obtido para o cloreto de cobre (CuCl2) foi de 12, 34, 48, 77, 86 e 95% de eficácia para larvas mistas de terceiro estágio (L3) nematodas de ovinos, e 12, 39, 47, 77, 89 e 95% de eficácia para larvas mistas de bovinos. Para o sulfato de cobre (CuSO4), a eficácia foi de: 5,0, 34, 49, 73, 87 e 97% para L3 de ovinos, e 8,0, 33, 47, 69, 84 e 93% para L3 de bovinos. Os resultados mostraram uma diferença (P < 0,05) na eficácia entre todas as concentrações das soluções, porém, quando as mesmas concentrações foram comparadas entre ovinos e bovinos, não houve diferença estatística. As concentrações inibitórias (CI) de 10, 30, 50, 70 e 90 foram estabelecidas através da análise das médias. Posteriormente, as CI de ambas as soluções foram testadas em combinação com as mesmas CI de NTX. As maiores eficácias encontradas contra L3 de ovinos nas combinações foram: 88% com a combinação de CI50 de CuCl2 e a CI10 de NTX, e 77% com a CI50 de CuSO4 e a CI10 de NTX. Para bovinos, a eficácia foi de 91% com a CI50 de CuCl2 e a CI10 de NTX, e 79% com a CI50 de CuSO4 e a CI10 de NTX. Os resultados mostraram que a CI50 de ambas as soluções, em combinação com o CI10 de NTX apresentaram efeito sinérgico, uma vez que a soma das eficácias foi maior que a soma das doses isoladas. Para os testes de eclodibilidade de ovos (TEO) e desenvolvimento larvar (TDL), foram utilizados ovos e larvas de parasitos de ovinos e aplicadas a CI10, CI50 e CI90 de CuCl2 e CuSO4. Foi observado um efeito concentração-dependente, pois a medida que a dose foi aumentada, uma menor quantidade de ovos eclodiu até L1 (TEO), e uma menor quantidade de L1 desenvolveu-se até L3 (TDL). Foi observada diferença na eficácia (P < 0,05) entre as concentrações, mas não entre as soluções. As soluções CuCl2 e CuSO4 foram utilizadas no TIA, nas concentrações de 30, 60, 120, 240, 480 e 1000 mM, água destilada como controle negativo e a combinação de cipermetrina a 20% e clorpirifós a 50%, como controle positivo. O cálculo da eficácia geral (TIA + eclodibilidade de larvas + taxa de reprodução) do CuCl2 foi de 81, 82, 87, 89, 100 e 100% e 61, 43, 62, 93, 100 e 98% para o CuSO4. Não foi observada diferença estatística entre as concentrações testadas (P > 0,05). Lâminas histológicas dos ovários das fêmeas de R. microplus foram confeccionadas para microscopia ótica. A visualização revelou alterações morfológicas nos ovócitos, vacuolização citoplasmática, perda da membrana plasmática, descaracterização da vesícula germinal e córion, perda da parede do ovário, alterações nucleares e degeneração vacuolar após tratamento com 240, 480 e 1000 mM de CuCl2 e CuSO4. Ambas soluções de Cu-II foram testadas em células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) com o objetivo de verificar sua viabilidade. Foi observada uma diminuição da viabilidade a partir da CI90 (695 µM de CuCl2 e 660 µM de CuSO4) após 24 e 48 h de incubação, no teste de MTT. Os dados apresentados são inéditos para as soluções CuCl2 e CuSO4 e demonstraram que as ambas foram eficazes contra endo e ectoparasitos nos testes in vitro. O sinergismo observado nas combinações do NTX com CuCl2 e CuSO4 nos testes in vitro de larvas de NGI, apresentaram um grande potencial para o desenvolvimento de novas formulações para controle de parasitos de ruminantes, potencializando a eficácia e ampliando o mecanismo de ação.

Abstract: The major health problem in livestock is the presence of parasite infections, being the main cause of the decreased welfare and loss of productivity in sheep and cattle. Given the great difficulty with parasite control in ruminants, the objective of this work was to demonstrate the efficacy of copper-based solutions (Cu-II chloride and sulfate) against gastrointestinal nematodes (GIN) and the Rhipicephalus microplus tick using a series of in vitro tests. In sheep and bovine coprocultures, have been identified larvae of Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Ostertagia sp., Oesophagostomum sp. and Cooperia spp. The egg hatch teste (EHT) and larval development teste (LDT) were used for NGI, and the larval migration inhibition test (LMIT) were used for GIN with Cu- II solutions. TIML was also used to test combination of Cu-II solutions with 34% nitroxinil (NTX). NTX was chosen because it has already been used routinely with the animals in this study. The adult immersion test (AIT) was used for R. microplus. The tests were made to verify the effectiveness of the isolated solutions at concentrations of 2.0, 7.0, 30, 125, 500 and 2000 µM. The result obtained for copper chloride (CuCl2) were 12, 34, 48, 77, 86 and 95% efficacy for third stage (L3) of mixed sheep nematodes, and 12, 39, 47, 77, 89 and 95% efficacy for mixed larvae of cattle. For copper sulphate (CuSO4), the efficacy was: 5.0, 34, 49, 73, 87 and 97% for sheep L3, and 8.0, 33, 47, 69, 84 and 93% for L3 of cattle. The results showed a difference (P < 0.05) in efficacy between all the concentrations of the solutions, but when the same concentrations were compared between sheep and cattle, there was no statistical difference. Inhibitory concentrations (IC) of 10, 30, 50, 70 and 90 were established through the analysis of the means. Afterwards, the LC of both solutions were combined with the same NTX IC. The highest efficacies found against sheep L3 in the combinations were, 88% with the combination of IC50 of CuCl2 and IC10 of NTX, and 77% with the IC50 of CuSO4 and IC10 of NTX. For cattle L3, the effectiveness was 91% with the IC50 of CuCl2 and the IC10 of NTX, and 79% with the IC50 of CuSO4 and IC10 of NTX. The results showed that the IC50 of both solutions in combination with the IC10 of NTX had a synergic effect, as the sum of the efficacies was higher than the sum of the isolated doses. For egg hatch test (EHT) and larval development test (LDT), eggs and larvae of sheep parasites were used and applied to IC10, IC50 and IC90 of CuCl2 and CuSO4. A concentration-dependent effect was observed, because as the dose was increased, a smaller amount of eggs hatched to L1 (EHA), and a lower amount of L1 developed to L3 (LDA). A difference in efficacy (P < 0.05) was observed between concentrations, but not between solutions. The CuCl2 and CuSO4 solutions were used in AIT, in the concentrations of 30, 60, 120, 240, 480 and 1000 mM were used, distilled water as a negative control and the combination of cypermethrin 20% and chlorpyrifos 50% as positive control. The overall efficiencies (AIT + egg hatch test + reproductive index) for CuCl2 were 81, 82, 87, 89, 100 and 100% and 61, 43, 62, 93, 100 and 98% for CuSO4. No statistic difference was observed between the concentrations tested (P > 0.05). The histological slides of the ovaries of R. microplus females were made for optical microscopy. The visualization revealed morphological changes in oocytes, cytoplasmic vacuolization, loss of plasma membrane, mischaracterization of the germinal vesicle and chorion, loss of the ovary wall, nuclear changes, and vacuolar degeneration after treatment 240, 480 and 1000 mM of CuCl2 and CuSO4. The solutions were tested in MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney) with the aim of verifying their viability in the presence of Cu-II solutions. A decrease in viability from the IC90 (695 µM of CuCl2 and 660 µM of CuSO4) were observed after 24 and 48 h of incubation, in the MTT. The results presented are unprecedent for the CuCl2 and CuSO4 solutions and demonstrated that both were effective against endo and ectoparasites in in vitro tests. The synergism observed in the combinations of NTX with CuCl2 and CuSO4 in vitro tests of GIN, presented a great potential for the development of new formulations to control ruminant parasites, enhancing the efficiency and expanding the action mechanism.