Efeitos pró-oxidantes e citotóxicos de nitrochalconas sintéticas livres ou encapsuladas em nanopartículas de poli metacrilato de metila sobre células HeLa

Abstract

Resumo: Novos antitumorais mais efetivos e com menos efeitos adversos são necessários para o tratamento do câncer. As chalconas são um grupo de polifenóis de origem natural que tem mostrado ampla variedade de ações biológicas incluindo a ação antitumoral. Modificações na estrutura química das chalconas têm sido realizadas com o intuito de melhorar suas atividades biológicas. Neste trabalho foi realizada, de forma comparativa, análise das atividades citotóxicas da chalcona (CH), 2'-hidroxichalcona (2HC), da 3-nitrochalcona (3NC) e da 2'- hidroxi-3-nitrochalcona (HNC) sobre células HeLa, com o objetivo de verificar a importância dos grupamentos nitro e hidroxil para a potencial atividade antitumoral destes compostos. Observou-se que as chalconas nitradas (3NC e HNC) foram as que tiveram maior efeito citotóxico. A HNC foi a nitrochalcona escolhida para a continuação do estudo de suas propriedades pró-oxidantes e o IC50 observado foi de 24 yM. A HNC (20 e 30 yM) aumentou a porcentagem de células hipodiplóides e com dupla marcação (anexina V/PI). HNC (30 yM) demonstrou a capacidade de formar aduto com GSH no interior da célula, reduzir os níveis de GSH e aumentar os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs). O efeito citotóxico de HNC não foi revertido com a adição de NAC (10 mM), mas a pré-incubação com BSO (100 yM) fez com que as células ficassem mais sensíveis aos efeitos da HNC (10 e 20 yM). Assim, pode-se sugerir que a HNC promove a morte de células HeLa, possivelmente por apoptose, e que seus efeitos pró-oxidantes podem, pelo menos em parte, colaborar para a indução da morte celular. Neste trabalho também foram analisados os efeitos sobre células HeLa da 4-nitrochalcona (4NC) livre e encapsulada em nanopartículas de polimetacrilato de metila com funcionalização (4NC-PMMA-AF) ou sem funcionalização com ácido fólico (4NC-PMMA). Os objetivos desta parte do trabalho foram verificar os efeitos citotóxicos da 4NC e da 4NC-PMMA-AF em comparação com a 4NC-PMMA em células HeLa que super-expressam receptor para ácido fólico (RAF). A 4NC (15 - 45 yM) promove efeitos citotóxicos de forma dependente da concentração com IC50 de 32.9 yM, sem alterar o ciclo celular nas concentrações testadas (20 e 30 yM). 4NC aumentou rapidamente os níveis de EROs e os efeitos sobre a viabilidade foram reduzidos com a préincubação com NAC. A pré-incubação com BSO deixou as células HeLa mais sensíveis aos efeitos da 4NC. A 4NC (30 yM) forma aduto com GSH em sistema livre de células. A depleção de GSH pode ser consequência do aumento de EROS. Nanopartículas com 4NC-PMMA-AF foram internalizadas, possivelmente por endocitose envolvendo o RAF. Essa entrada promoveu efeitos citotóxicos em media 25% superiores aos da 4NC livre (15 e 30 yM), sugerindo que esta pode ser uma maneira eficiente de entrega da 4NC para gerar seus efeitos em células HeLa. Desta forma, pode-se concluir que as chalconas nitradas promovem efeitos citotóxicos e pró-oxidantes sobre as células HeLa e que a utilização de nanopartículas funcionalizadas de PMMA-AF podem ser uma forma promissora de entrega deste tipo de compostos a este tipo de células. Palavras chave: Nitrochalconas. HeLa. Espécies reativas de oxigênio. Glutationa. Nanopartícula. Ácido fólico.

Abstract: Novel and more effective antitumor drugs with less adverse side effects are necessary to cancer treatment. Chalcones are polyphenols of natural origin that have shown a wide variety of biological effects including the antitumoral action. Modifications in the chemical structure of chalcones have been conducted in order to improve their biological activities. In this study, we conducted a comparative analysis of the cytotoxic activities of the chalcone (CH), 2'- hydroxychalcone (HC), 3-nitrochalcone (3NC) and 2'-hydroxy-3-nitrochalcone (HNC) on HeLa cells. The objective of the study was to verify the importance of the nitro and the hydroxyl groups in order to test the potential antitumor activity of these compounds. We founded that the nitrated chalcones (3NC and HNC) were those that had the highest cytotoxic effect. We chose HNC to continue the study of its mechanism of action and pro-oxidant properties, and the IC50 observed for it was 24 yM. The HNC (20 and 30 yM) was able to increase the percentage of hypodiploid and double-labeled cells (annexin V/PI). HNC demonstrate the capacity to form an adduct with GSH inside the cell, reduced GSH levels and increase the levels of reactive oxygen species (ROS). The cytotoxic effect of HNC was not reversed with the addition of NAC (10mM); however, pre-incubation with BSO (100 yM) made the HeLa cells more sensitive to the effects of HNC (10 and 20 yM). Thus, it may be suggested that HNC promotes tumor cell death, possibly by apoptosis, and that its pro-oxidant effects may, at least in part, induce cell death. In this study, were also analyzed the effects of 4-nitrochalcone (4NC) free and encapsulated on polymethyl methacrylate nanoparticles functionalized (4NC-PMMA-FA) or not with folic acid (FA) on HeLa cells. For this part of the study the objectives were to assess the cytotoxic and pro-oxidant effects of 4NC and to verify if using PMMA-AF compared to PMMA would collaborate with the delivery of 4NC to HeLa cells that overexpress the folate receptor (RFA). The 4NC (15 - 45 yM) promotes cytotoxic effects in a concentration-dependent manner with an IC50 of 32.9 yM, without affecting the cell cycle at the tested concentrations (20 e 30 yM). 4NC rapidly increases the levels of ROS and the effects on cell viability were reduced by pre-incubation with NAC. Pre-incubation with BSO turn the cells more sensitive to the effects of 4NC. 4NC (30 yM) formed an adduct with GSH in a cell-free system. GSH depletion may be a consequence of increased ROS. Nanoparticles with 4NC encapsulated in PMMA-AF were internalized, possibly through an endocytic mechanism involving RFA. This entry promoted 25% higher cytotoxic effects than free 4NC (15 and 30 yM), suggesting that this could be an efficient way to deliver 4NC in order to generate its effect in HeLa cells. Thus, we conclude that nitrated chalcones promote cytotoxic and prooxidant effects on HeLa cells and that the use of PMMA-AF functionalized nanoparticles containing 4NC may be a promising strategy to the delivery of these types of compounds at these cells. Keywords: Nitrochalcones. HeLa. Reactive oxygen species. Glutathione. Nanoparticles. Folic acid.