Determinação dos mecanismos de uptake de vesículas extracelulares de Giardia intestinalis e seus efeitos fenotípicos em células hospedeiras

Abstract

Resumo: Giardia intestinalis é um protozoário flagelado responsável pela giardíase, uma das infecções diarreicas intestinais mais comuns mundialmente, especialmente em regiões com saneamento inadequado. A interação entre G. intestinalis e as células do hospedeiro envolve mecanismos complexos, incluindo a liberação de vesículas extracelulares (VEs), partículas de bicamada lipídica que atuam na comunicação celular via transporte de biomoléculas. Este estudo investigou os mecanismos diferenciais de "uptake" de VEs derivadas de G. intestinalis (gEVs), das células hospedeiras (hEVs) e das vesículas formadas durante a interação parasita-hospedeiro (intEVs) em células intestinais Caco-2. Os resultados demonstraram que as intEVs são internalizadas mais rapidamente. Para elucidar as vias de internalização, foram aplicados diversos inibidores de endocitose, incluindo MDC, genisteína, EIPA e Dynasore. As análises revelaram que as gEVs utilizam predominantemente vias dependentes de dinamina e clatrina, sendo independentes de caveolas e balsas lipídicas, mas moduladas por sinalização de tirosina quinase e macropinocitose. Em culturas 3D de Caco-2 e HT-29, a interação com VEs resultou na quebra da barreira epitelial, evidenciada pela redução na resistência elétrica transepitelial (TEER) e aumento da permeabilidade paracelular. Análises ômicas revelaram diferenças marcantes entre os subtipos de VEs. A lipidômica indicou uma maior abundância de esfingolipídios e colesterol nas intEVs, sugerindo um papel na modulação da fusão e internalização dessas vesículas. A proteômica demonstrou que, nas primeiras 1 hora de interação, as intEVs apresentaram maior expressão de proteínas associadas à adesão e remodelamento do citoesqueleto, como integrinas e actinas, enquanto após 24 h, foram observadas proteínas relacionadas à evasão imunológica e modulação de resposta inflamatória, como galectinas e proteínas de choque térmico. Por outro lado, as gEVs mostraram enriquecimento em proteínas de virulência nas fases iniciais, enquanto as hEVs apresentaram proteínas associadas à resposta ao estresse celular em 24 h. Estas descobertas oferecem novos alvos terapêuticos para mitigar os efeitos da giardíase e aprofundam a compreensão do papel das VEs na modulação da barreira intestinal e na persistência do parasita

Abstract: Giardia intestinalis is a flagellated protozoan responsible for giardiasis, one of the most common intestinal diarrheal infections worldwide, especially in regions with inadequate sanitation. The interaction between G. intestinalis and host cells involves complex mechanisms, including the release of extracellular vesicles (EVs), lipid bilayer particles that act in cellular communication via the transport of biomolecules. This study investigated the differential mechanisms of "uptake" of G. intestinalis-derived EVs (gEVs), host cell-derived EVs (hEVs), and vesicles formed during the parasite-host interaction (intEVs) in Caco-2 intestinal cells. The results demonstrated that intEVs are internalized more rapidly. To elucidate the internalization pathways, various endocytosis inhibitors were applied, including MDC, genistein, EIPA, and Dynasore. The analyses revealed that gEVs predominantly utilize dynamin- and clathrin- dependent pathways, being independent of caveolae and lipid rafts, but modulated by tyrosine kinase signaling and macropinocytosis. In 3D cultures of Caco-2 and HT-29, interaction with EVs resulted in the disruption of the epithelial barrier, evidenced by a reduction in transepithelial electrical resistance (TEER) and increased paracellular permeability. Omic analyses revealed striking differences between the EV subtypes. Lipidomics indicated a higher abundance of sphingolipids and cholesterol in intEVs, suggesting a role in the modulation of fusion and internalization of these vesicles. Proteomics showed that, within the first hour of interaction, intEVs exhibited higher expression of proteins associated with adhesion and cytoskeletal remodeling, such as integrins and actins, while after 24 hours, proteins related to immune evasion and modulation of inflammatory response, such as galectins and heat shock proteins, were observed. In contrast, gEVs showed enrichment in virulence proteins in the early stages, while hEVs displayed proteins associated with cellular stress response after 24 hours. These findings offer new therapeutic targets to mitigate the effects of giardiasis and deepen the understanding of the role of EVs in modulating the intestinal barrier and parasite persistence