Estudos sobre piruvato desidrogenases quinases como potenciais alvos para novas quimioterapias da toxoplasmose

Abstract

Resumo: Toxoplasma gondii constitui o agente etiológico da toxoplasmose, doença de abrangência global e que afeta principalmente pacientes imunocomprometidos e bebês durante o desenvolvimento gestacional, desencadeando severas manifestações clínicas que incluem encefalite, alterações oculares e até mesmo transtornos psiquiátricos. Os fármacos atuais apresentam diversos efeitos adversos aos pacientes e são efetivos apenas sobre a fase proliferativa dos parasitos. Uma das possíveis vias a serem exploradas para novos tratamentos pode estar relacionada ao metabolismo energético de Toxoplasma, que diferente dos demais organismos, privilegia as vias glicolíticas como principal fonte de ATP. Na literatura é apontado que na ausência do complexo piruvato desidrogenase (PDH) mitocondrial em Toxoplasma e demais apicomplexas, ocorreu uma reconversão bioquímica do complexo desidrogenase de alfa-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKDH), o qual assumiu uma função enzimática do tipo PDH, ou seja, voltada à conversão do piruvato, diferente do seu papel "canônico" voltado ao metabolismo de aminoácidos ramificados, como ocorre nos demais organismos. O complexo BCKDH geralmente é regulado pela quinase BCKDK, enquanto o complexo PDH tem como enzima regulatória a quinase PDK. Essas quinases fosforilam resíduos de serina presentes na subunidade E1-alfa dos seus respectivos complexos desidrogenases. Entretanto, em Toxoplasma são reportadas as quinases PDK e BCKDK na mitocôndria dos parasitos, mantendo-se como uma questão em aberto qual dessas enzimas estaria participando da regulação do complexo BCKDH, e, indiretamente, promovendo a predominância das vias glicolíticas. Dados anteriores do nosso grupo de pesquisa apontaram que o ácido dicloroacético (DCA), droga voltada à inibição da quinase PDK em modelos tumorais, reduz a proliferação dos parasitos in vitro. Dessa forma, esse trabalho busca compreender se as quinases TgPDK e/ou TgBCKDK atuam regulando o complexo BCKDH de Toxoplasma e se essas enzimas seriam os alvos biológicos de DCA. Para elucidar essa questão metabólica, utilizamos diferentes abordagens, envolvendo análises filogenéticas, ensaios enzimáticos, análises por docking molecular e técnicas de imunoprecipitação. Até o momento a literatura aponta a existência de somente uma subunidade E1-alfa (E1-alfa-01) para o complexo BCKDH dos parasitos, entretanto, nossas análises filogenéticas apontaram a existência de uma nova subunidade, que denominamos como E1-alfa-02, ainda não reportada na literatura. Nossos testes enzimáticos apontaram que a quinase recombinante BCKDK aumenta a sua atividade catalítica in vitro na presença de peptídeos sintéticos relacionados tanto à E1-alfa-01 quanto E1-alfa-02, sugerindo que a nova subunidade identificada também é um alvo biológico dessa quinase. Abordagens de imunoprecipitação, seguidas de análises proteômicas, identificaram que o componente E2 do complexo BCKDH está associado a ambas as quinases (TgPDK e TgBCKDK), reforçando a hipótese de que ambas as enzimas poderiam atuar sobre a regulação de ambas as subunidades E1-alfa de BCKDH. Além disso, análises de docking molecular indicaram a ligação de DCA em BCKDK e PDK, e ensaios enzimáticos confirmaram o efeito inibidor de DCA sobre a atividade de BCKDK, o que amplia o entendimento sobre a atuação desse fármaco no metabolismo de Toxoplasma

Abstract: Toxoplasma gondii is the etiological agent of toxoplasmosis, a globally widespread disease that primarily affects immunocompromised individuals and fetuses during gestational development, triggering severe clinical manifestations such as encephalitis, ocular alterations, and even psychiatric disorders. Current drugs have various adverse effects on patients and are only effective against the proliferative stage of the parasites. One potential pathway for the development of new treatments involves the energy metabolism of Toxoplasma, which, unlike many other organisms, relies predominantly on glycolytic pathways as its main source of ATP. According to the literature, in the absence of mitochondrial pyruvate dehydrogenase (PDH) complex in Toxoplasma and other apicomplexans, the branched-chain a-keto acid dehydrogenase (BCKDH) complex has undergone biochemical repurposing, acquiring a PDH-like enzymatic function directed toward pyruvate conversion. This function diverges from its canonical role in branched-chain amino acid metabolism, as seen in other organisms. The BCKDH complex is typically regulated by the BCKDH kinase (BCKDK), while the PDH complex is regulated by pyruvate dehydrogenase kinase (PDK). These kinases phosphorylate serine residues on the E1-alpha subunits of their respective dehydrogenase complexes. However, in Toxoplasma, both PDK and BCKDK have been reported in the mitochondria, raising the question of which enzyme is responsible for regulating the BCKDH complex and thereby contributing to the parasite’s glycolytic predominance. Previous data from our research group indicated that dichloroacetic acid (DCA), a drug known to inhibit PDK in tumor models, reduces parasite proliferation in vitro. This study aims to determine whether TgPDK and/or TgBCKDK regulate the BCKDH complex in Toxoplasma and whether these kinases are biological targets of DCA. To explore this metabolic question, we employed several approaches, including phylogenetic analyses, enzymatic assays, molecular docking, and immunoprecipitation techniques. While the literature describes only one E1-alpha subunit (E1-alpha-01) for the BCKDH complex in Toxoplasma, our phylogenetic analyses identified a previously unreported subunit, which we named E1-alpha-02. Enzymatic assays demonstrated that recombinant BCKDK exhibits increased catalytic activity in the presence of synthetic peptides corresponding to both E1-alpha-01 and E1-alpha-02, suggesting that the newly identified subunit is also a target of this kinase. Immunoprecipitation followed by proteomic analysis revealed that the E2 component of the BCKDH complex interacts with both TgPDK and TgBCKDK, supporting the hypothesis that both kinases may regulate the E1-alpha subunits. Furthermore, molecular docking analyses showed that DCA binds to both BCKDK and PDK, and enzymatic assays confirmed DCA's inhibitory effect on BCKDK activity. These findings expand our understanding of DCA’s action on Toxoplasma metabolism