A proteína de sinalização glnk atua como uma subunidade regulatória dissociável da enzima UmpH de Escherichia Coli
Resumo
Resumo : As proteínas da família PII são ubíquas em bactérias, arqueias e plantas e possuem a capacidade de sentir os níveis celulares de energia, carbono e nitrogênio, através da ligação de moduladores alostéricos ATP, ADP e 2 oxoglutarato (2-OG). As proteínas PII possuem a capacidade de interagir fisicamente, regulando a atividade de diversas proteínas-alvo. A bactéria Escherichia coli possui duas proteínas PII, sendo elas GlnK e GlnB. A enzima UMP fosfatase (UmpH) também está presente em E. coli e faz parte da via de degradação de nucleotídeos da classe pirimidina, removendo grupos fosfato do monofosfato de uridina (UMP). Trabalhos anteriores identificaram a enzima UmpH como possível alvo da proteína GlnK, mas até então era desconhecido o significado fisiológico da interação física entre essas proteínas. Este trabalho teve como objetivo caracterizar a interação entre as PII de E. coli e UmpH. Ensaios de pull-down e Biolayer Interferometry (BLI) confirmaram que a interação só ocorre entre UmpH e GlnK, na ausência de efetor e na presença de ADP e ATP, com ADP mantendo o complexo mais estável e com maior afinidade de ligação (Kd= 7.8 nM). A interação é interrompida na presença de ATP e 2-OG combinados ou quando GlnK se encontra na sua forma modificada por uridililação. Ensaios de atividade enzimática de UmpH evidenciaram que GlnK age como um inibidor de UmpH, diminuindo a atividade enzimática em até 50%, aumentando o Km de UMP em 2,3x e diminuindo a velocidade máxima de reação em torno de 30%. Esta inibição é dose-dependente, quanto maior a concentração de GlnK maior foi a inibição de UmpH, até atingir uma saturação. O efeito inibitório de GlnK só é observado nas condições em que foi detectada a formação do complexo UmpH-GlnK, sem efetor ou na presença de ADP/ATP. Através do alinhamento de sequências com PII ortólogas de Azospirillum brasilense, verificamos a existência de 11 resíduos únicos em GlnB de E. coli que estão na superfície e se concentram na cadeia lateral da proteína. Esses resíduos podem ser críticos na interação e formação do complexo UmpH-GlnK. Além disso, ensaios de pull-down com PII ?loopT de A. brasilense mostraram que o loop-T não aparenta ser necessário para a interação de UmpH. O complexo GlnK-UmpH parece ocorrer em uma situação de alta disponibilidade de nitrogênio na célula, quando os níveis de nitrogênio aumentam e os níveis de 2-OG caem rapidamente, para a adequação do estado celular catabólico para o anabólico. Com esses resultados, temos a primeira confirmação da regulação da proteína GlnK sob a atividade enzimática de UmpH e seu envolvimento na adequação do metabolismo, apoiando estudos anteriores do seu papel central de PII na coordenação de diferentes vias metabólicas.