Atenuação de Trypanosoma cruzi para criação de vetor vacinal seguro e livre de marcas de resistência

Abstract

Resumo: A doença de Chagas é considerada a terceira maior doença parasitária, tem como tratamento os medicamentos Nifurtimox e o Benzonidazol, que possuem alta toxicidade e causam diversos efeitos colaterais, tendo assim uma necessidade de buscar novos meios de prevenção, como o desenvolvimento de vacinas. Esse trabalho tem como objetivo gerar parasitas atenuados por meio da edição de gene essencial para o desenvolvimento de formas infectivas no hospedeiro mamífero. Para isto, escolhemos os genes de Centrina 4 e PFR2 de Trypanosoma cruzi (TcCTN4 e TcPFR2) utilizando a técnica de CRISPR/Cas9, a fim de obter um vetor vacinal mais seguro. A partir do gene de Centrina 4 de Leishmania foi possível identificar os ortólogos em tripanosomatídeos (identidade superior a 89%). TcCTN4 apresenta 91,95% de identidade com o ortólogo em L. major, que já foi nocauteado e que tem sido utilizado como vacina. Para as edições gênicas, transfectamos com o complexo de sgRNA e SaCas9, e o DNA doador simples fita em epimastigotas de T. cruzi da cepa Colombiana superexpressando os genes repórteres tdTomato e Luciferase. Após a confirmação da edição, clonamos os parasitas por diluição limitante e identificamos vários clones com a edição completa para Centrina 4 ou de PFR2. Na tentativa de obter parasitos duplo mutantes, o clone TcCTN4 -/- foi transfectado para editação do gene TcPFR2. Contudo após a clonagem, não encontramos nenhum clone nocaute completo de TcPFR2, apenas com a interrupção de Centrina 4. Diversas tentativas foram feitas, e não foi possível conseguir um clone com o nocaute de ambos os genes. Epimastigotas TcCTN4 -/- apresentaram diversas alterações morfológicas e redução significativa na taxa de crescimento após sete dias. Na diferenciação in vitro, TcCTN4 -/- exibiu uma menor proporção de formas metacíclicas. Em células VERO infectadas, os parasitas TcCTN4 -/- apresentaram uma baixa taxa de infecção (1,35% comparado a 6,39% dos TcCTN4 +/+). Amastigotas TcCTN4 -/- tiveram uma taxa de replicação significativamente reduzida e não se transformaram em tripomastigotas. Em camundongos infectados, apenas parasitas TcCTN4 +/+ mostraram bioluminescência, indicando maior infectividade. Análises de sangue revelaram uma resposta imune específica apenas em camundongos infectados com TcCTN4 +/+. Animais infectados com TcCTN4 -/- não apresentaram inflamação visível no local da infecção e tiveram baixa parasitemia, sugerindo uma redução significativa na virulência. Este estudo demonstra que a interrupção dos genes TcCTN4 e TcPFR2 afeta negativamente a morfologia, a taxa de crescimento, a diferenciação e a infectividade dos parasitas. Esses resultados destacam a importância dessas proteínas no ciclo de vida e na patogenicidade do T. cruzi, sugerindo que a edição gênica pode ser uma abordagem eficaz para reduzir a virulência e a capacidade infecciosa do parasita

Abstract: Chagas disease is considered the third largest parasitic disease and is currently treated with the drugs Nifurtimox and Benznidazole, both of which have high toxicity and cause various side effects. This creates a need to explore new preventive measures, such as the development of vaccines. This work aims to generate attenuated parasites through the editing of essential genes required for the development of infective forms in mammalian hosts. To achieve this, we selected the Centrin 4 of Trypanosoma cruzi (TcCTN4) as target gene to create a safer vaccine vector using the CRISPR/Cas9 system. Based on the Centrin 4 gene from Leishmania, we identified orthologs in trypanosomatids (with over 89% identity). TcCTN4 shares 91.95% identity with its ortholog in L. major, which has already been knocked out and used as a vaccine. In addition to TcCTN4, we also edited the paraflagellar rod protein 2 (PFR-2) genes, based on previously published data. For gene editing, we transfected T. cruzi Colombiana strain epimastigotes, which express tdTomato and luciferase, with a complex of sgRNA and SaCas9, along with single- stranded donor DNA. After confirming the gene editing in the parasite population, the parasites were cloned through limiting dilution, and several clones were identified with complete editing of Centrin 4 or TcPFR2. The TcCTN4 -/- clone was transfected to edit the PFR2 gene. After genotyping several clones for gene editing, we did not identify any mutant clone containing both genes edited. TcCTN4 -/- epimastigotes exhibited various morphological changes and a significant reduction in growth rate. In in vitro differentiation, TcCTN4 -/- showed a lower proportion of metacyclic forms. TcCTN4 -/- parasites display lower infection rate of VERO cells (1.35% compared to 6.39% for TcCTN4 +/+), and TcCTN4 -/- amastigotes show a dramatic reduction on replication rate and do not transform into trypomastigotes. When mice were infected mice, only TcCTN4 +/+ parasites showed bioluminescence, indicating higher infectivity. Blood analyses revealed a specific immune response only in mice infected with TcCTN4 +/+. Animals infected with TcCTN4 -/- did not exhibit visible inflammation at the infection site and had low parasitemia, suggesting a significant reduction in virulence. This study demonstrates that the disruption of the Centrin 4 and PFR2 genes in T. cruzi negatively affects the parasite's morphology, growth rate, differentiation, and infectivity. These results underscore the importance of these proteins in the life cycle and pathogenicity of T. cruzi, suggesting that gene editing could be an effective approach to reduce the virulence of this parasite