Perfil metabolômico baseado em RMN 1H de amostras plasmáticas de pacientes em diferentes estágios da doença renal crônica

Abstract

Resumo: A doença renal crônica (DRC) é um sério problema de saúde pública que afeta milhares de pessoas em todo o mundo. Atualmente, o diagnóstico da DRC é usualmente realizado com base nos níveis da taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) e na albuminúria, limitando o conhecimento dos mecanismos envolvidos na progressão desta patologia. A elucidação do comportamento metabólico da DRC pode auxiliar na prevenção e no diagnóstico desta enfermidade. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi identificar mudanças no perfil metabolômico, que ocorrem à medida que a DRC progride. Para tanto, 77 amostras de plasmas de pacientes foram classificadas de acordo com seus respectivos níveis de TFGe e albuminúria. Todas as amostras foram submetidas à precipitação proteica e posteriormente à espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H, além de um robusto tratamento estatístico. Os espectros de RMN de 1H 1D e 2D em 600 MHz foram determinados com o auxílio de técnicas de pré-saturação de solvente (noesyprld) e correlação 1H-13C editada (HSQCed), o que permitiu a identificação de 35 metabólitos, além de 12 deslocamentos químicos não determinados. Os analitos identificados foram submetidos a plataforma estatística de análise de rota metabólica (MetPA), a qual identificou 13 vias metabólicas e diversas moléculas específicas que estão envolvidas na fisiopatologia da DRC. As principais rotas metabólicas determinadas (p <0,05) foram a da biossíntese de RNAt ligado a aminoácidos, biossíntese, metabolismo e degradação de aminoácidos, além do metabolismo de butanoato, glioxilato e dicarboxilato. A análise de componentes principais (ACP) discriminou os pacientes do estudo em três grupos de acordo com seus respectivos comportamentos metabolômicos e encontrou 8 metabólitos envolvidos na distinção entre os grupos DRC e controle. Desta forma, os pacientes foram discriminados metabolomicamente pela ACP, de acordo com a TFGe, em grupo controle, estágios I - IV (G1 - G4) e estágio V (G5). A Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (ADMQP), baseada na TFGe, apresentou uma calibração e validação de acurácia de 100%, além de permitir, com base nas limitações deste estudo, a criação de um modelo capaz de classificar novos pacientes de acordo com o perfil de metabólitos encontrados nos espectros de RMN de 1H. A Análise de Variância (ANOVA) dos níveis plasmáticos dos analitos quantificáveis apresentou alterações significativas à medida que a DRC progride. Alterações metabólicas associadas à glicólise e gliconeogênese permitiram discriminar pacientes DRC e controle. A determinação de moléculas envolvidas na geração do N-óxido de trimetilamina (TMAO) sugere um importante papel desta toxina urêmica associada à DRC e a doenças cardiovasculares. Esses e outros achados demonstram que existem diferenças metabolômicas na coorte de pacientes estudada, além de que várias vias metabólicas específicas estão estatisticamente correlacionadas com esta patologia. Por conseguinte, os resultados apresentados sugerem a possibilidade de avaliar a DRC de acordo com seu comportamento metabolômico e não apenas por biomarcadores isolados, demonstrando assim uma nova perspectiva para o entendimento da fisiopatologia desta doença.

Abstract: Chronic Kidney Disease (CKD) is a serious public health issue that affects thousands all over the world. Currently, the diagnosis of CKD is made usually on the levels of the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and albuminuria, limiting the knowledge of the mechanisms involved in the progression of this pathology. The elucidation of the CKD metabolic behavior may help in the prevention and diagnose of this sickness. In this sense, the aim of the present study was to identify changes in the metabolomic profile that occur as CKD progresses. Therefore, 77 plasma samples from patients classified according to their respective levels of eGFR and albuminuria. All samples were subjected to protein precipitation and subsequently to 1H Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy, in addition to robust statistical treatment. The 1H 1D and 2D NMR spectra at 600 MHz were determined with the aid of solvent pre-saturation techniques (noesyprld) and edited 1H-13C correlation (HSQCed), which allowed the identification of 35 metabolites, in addition to 12 undetermined chemical shifts. The identified analytes were submitted to the statistical metabolic route analysis platform (MetPA), which found 13 metabolic pathways and several specific molecules that are involved in CKD pathophysiology. The main metabolic routes determined (p <0.05) were the biosynthesis of tRNA linked to amino acids, biosynthesis, metabolism and degradation of amino acids, in addition to the metabolism of butanoate, glyoxylate and dicarboxylate. Principal component analysis (PCA) discriminated the study patients into three groups according to their respective metabolomic behaviors and found 8 metabolites involved in the distinction between the CKD and control groups. Thus, the patients were metabolically discriminated by PCA, according to eGFR, in a control group, stages I - IV (G1 - G4) and stage V (G5). The Discriminant Analysis by Partial Least Squares (PLS-DA), based on eGRF, showed a 100% accuracy calibration and validation, in addition, based on the limitations of this study, to allowing the creation of a model capable of classifying new patients based on the profile of metabolites found in the 1H NMR spectra. The Analysis of Variance (ANOVA) of quantitative metabolites plasma levels showed significant changes as CKD advance. Metabolic changes associated with glycolysis and gluconeogenesis allowed to discriminate between CKD and control patients. The determination of molecules involved in the generation of trimethylamine N-oxide (TMAO) suggests an important role of this uremic toxin associated with CKD and cardiovascular diseases. These and other findings demonstrate that there are metabolomic differences in the studied patients cohort, in addition to the fact that several specific metabolic pathways are statistically correlated with this pathology. Therefore, the results presented suggest the possibility of assessing CKD according to its metabolomic behavior and not just by isolated biomarkers, thus demonstrating a new perspective for understanding the pathophysiology of this disease.