Aspectos moleculares e celulares de queratinócitos e fibroblastos in vitro induzidos por veneno e fosfolipases-D recombinantes de aranha-marrom

Abstract

Resumo: As aranhas-marrons do gênero Loxosceles são aracnídeos cosmopolitas com presença confirmada nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. A alta incidência de acidentes por picadas de Loxosceles torna o envenenamento um importante problema de saúde pública. Os sintomas mais comuns incluem lesões necróticas no local da picada, ocasionalmente acompanhadas por manifestações sistêmicas como febre, hemólise, trombocitopenia e insuficiência renal aguda. O veneno das Loxosceles é uma complexa mistura de moléculas bioativas, destacando-se enzimas como proteases, hialuronidases e fosfolipases-D (PLD). As PLD, conhecidas por suas propriedades dermonecróticas, desempenham um papel crucial na indução da resposta inflamatória local exacerbada e na necrose tecidual. Estudos recentes focaram em identificar os alvos moleculares e celulares das PLD, evidenciando que a ação dessas toxinas pode variar significativamente dependendo do tipo celular e da composição lipídica da membrana. Neste trabalho, foram utilizadas as linhagens celulares de queratinócitos humanos (HaCaT) e fibroblastos humanos (HFF-1) para investigar os efeitos do veneno total de Loxosceles intermedia e das PLD recombinantes LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A. As análises morfológicas detalhadas revelaram diferenças marcantes nas respostas celulares, associadas à composição lipídica da membrana e ao metabolismo celular específico de cada linhagem. Além disso, foram realizadas análises abrangentes de viabilidade celular, citotoxicidade, morte celular, proliferação celular e efeitos das PLD nas propriedades da membrana celular, empregando métodos avançados de preparo de amostras para análise molecular. Os resultados revelam que as diferenças na composição lipídica da membrana celular desempenham um papel fundamental nas respostas celulares ao veneno e às PLD de Loxosceles intermedia. Isso destaca a necessidade de investigações adicionais sobre metabólitos secundários liberados e seu potencial impacto na comunicação celular e na regulação da resposta inflamatória. Essas descobertas contribuem significativamente para o entendimento dos mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos do veneno de Loxosceles em nível celular, transcendendo a simples atividade enzimática direta, e podem orientar investigações futuras e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes.

Abstract: Brown spiders of the Loxosceles genus are cosmopolitan arachnids present in the Southern and Southeast regions of Brazil. A high rate of Loxosceles spider bites induce envenomation which became a significant public health issue worldwide. Frequent symptoms include necrotic lesions at the bite site, occasionally accompanied by systemic manifestations such as fever, hemolysis, thrombocytopenia, and acute renal failure. Loxosceles sp. venom is a complex mixture of bioactive molecules, with enzymes including a variety of proteases, hyaluronidases, and phospholipases-D (PLD) specially being prominent. PLDs, known for their dermonecrotic properties, play a crucial role in inducing an exacerbated local inflammatory response and tissue necrosis. Recent studies have focused on identifying the molecular and cellular targets of PLDs, highlighting that action of these toxins can vary significantly depending on cell type and lipid membrane composition. On this Thesis, human keratinocytes (HaCaT) and human fibroblasts (HFF-1) were used to investigate effects of whole crude venom from Loxosceles intermedia (total venom) and recombinant PLDs isoforms LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A. Detailed morphological findings revealed striking differences in cellular responses to venom toxins. Changes on membrane lipid composition and metabolism of each cell line depicted loss of cell spreading and detachment of rounded shaped cells or debris developed from cytoplasmic retraction noticeable by refringent contrast with nuclear areas on elongated cells. Furthermore, comprehensive analyses of cell viability and proliferation, were approached by cell-based-assays to measure cytotoxic effects and cell death by PLDs. PLD activity upon cell membranes evaluated using organic-enriched extracts solubilized for spectrometric and chromatographic tests indicated differences in PLD affinity and ability to act upon the different components. In fact, even the mutated isoform, which has less intense phospholipase activity, still induced mild changes like previously observed in endothelial cells or in animal models by Loxosceles venoms. The release of secondary metabolites by membrane disturbances have an impact on cellular communication through regulation of major recruitment of immune cells to the bite site. Skin cell membranes hydrolyzed turned into bioactive lipids signals throughout the dermis structures. Molecular mechanisms underlying the activation of multiple pathways subjected to effects of Loxosceles venom at the cellular level, with regards to those mediated by lipids, goes beyond simple direct enzymatic activity, therefore, it request a deeper assessment of cytotoxic effects of toxins to guide future researches for effective development on therapeutic strategies.