Polissacarídeos de pata-de-vaca (Bauhinia forficata Link) : caracterização estrutural e atividade biológica

Abstract

Resumo: Bauhinia forficata Link é uma planta medicinal popularmente conhecida como patade- vaca e possui diversas aplicações biológicas, entre elas tratamento da inflamação e como complementar no tratamento do diabetes. Este trabalho teve como objetivo geral extrair e isolar uma fração rica em polissacarídeos das folhas de B. forficata, os caracterizar estruturalmente e avaliá-los quanto a sua contribuição para a atividade hipoglicemiante e antidiabética in vivo e para a atividade anti-inflamatória in vitro. A partir do extrato aquoso feito com as folhas da planta foram obtidas duas frações: BFSGD (BFSF), sobrenadante do processo de congelamento e degelo a temperatura ambiente, e TCA-S, sobrenadante do tratamento da fração BFSGD com ácido tricloroacético (TCA), com a finalidade de desproteinização. Em relação à fração BFSGD, ela apresentou perfil de eluição quase homogêneo na análise de homogeneidade por HPSEC-RI e nas análises de dosagens espectrofotométricas apresentou 50,4% de açúcares totais, 15,1% de proteínas, e 15,0% de compostos fenólicos. A análise de composição monossacarídica por GC apresentou 27,4% de arabinose, 23,7% de galactose, 16,1% de ramnose, 13,8% de glucose, 6,2% de manose, 2,5% de xilose, 0,3% de fucose e 10,0% de ácido galacturônico, este último determinado por método colorimétrico. Através das análises de RMN e metilação, foi possível concluir que os polissacarídeos presentes na fração BFSGD são homogalacturonana, arabinana, amido e arabinogalactanas tipos I e II. A fração BFSGD, nas doses de 10, 30, 100 e 300 mg/kg, foi analisada quanto ao seu potencial hipoglicemiante pelo modelo animal de diabetes induzido por estreptozotocina em ratos. Foram avaliados os efeitos agudo (3 h) e crônico (21 dias) da fração sobre os animais. A fração não promoveu alteração na glicemia em comparação ao grupo controle, tratado apenas com salina, no período do experimento. Após o período do teste e eutanásia dos animais, o sangue foi coletado e foram realizadas análises de parâmetros bioquímicos e hematológicos. Dentre os parâmetros avaliados, observou-se diferença estatística em relação aos níveis de bilirrubina conjugada, ocorrendo diminuição de 63,7% na dose de 10 mg/kg e de 54,6% na dose de 30 mg/kg, e foi observada diminuição dos níveis de enzima AST: a fração na dose de 10 mg/kg foi capaz de reduzir em 43,7% sua concentração em comparação ao grupo controle. Os estudos histológicos de fígado demonstraram que a fração, nas doses de 30 e 100 mg/kg, foi capaz de amenizar significativamente o aparecimento e a intensidade de injúria tecidual, em 67,0% e 69,4%, respectivamente. Esses resultados indicam efeito hepatoprotetor exercido pela fração BFSGD. Em relação à TCA-S, a fração apresentou perfil de eluição homogêneo em HPSEC-RI, 81,6% de açúcares totais, 12,6% de compostos fenólicos e 4,7% de proteínas totais e é constituída de 38,2% de arabinose, 20,0% de galactose, 17,6% de ramnose, 15,1% de glucose, 6,3% de manose, 1,4% de xilose e 1,3% de ácido galacturônico. As análises de RMN e metilação demonstraram que a fração é constituída principalmente por arabinogalactanas tipos I e II, arabinana e amido. O amido foi removido de TCA-S através de tratamento com [alfa]-amilase, e a fração livre de amido foi renomeada TCAS [alfa]. A avaliação do potencial imunomodulatório de TCA-S [alfa], realizado através de células THP-1, demonstrou que a fração apresenta propriedade imunoestimulatória nas concentrações 50, 100 e 500 [microgramas]/mL, aumentando a concentração de todas as citocinas quantificadas no sobrenadante do cultivo celular (TNF- [alfa], IL-1 [beta] e IL-10), e efeito imunomodulador na presença de LPS, na concentração de 50 [microgramas]/mL. A razão entre as concentrações das citocinas pró e anti-inflamatórias, estimuladas pelo controle positivo (LPS) sozinho e por TCA-S [alfa] junto com LPS foi calculada para cada concentração. A diminuição dos valores das razões em todas as concentrações do grupo TCA-S [alfa] + LPS em comparação com ao controle positivo pode sugerir que a fração polissacarídica tenha efeito imunomodulador quando incubada simultaneamente com LPS.

Abstract: Bauhinia forficata Link is a medicinal plant popularly known as cow's paw and has several biological applications, including treatment of inflammation and as an adjutant in the treatment of diabetes. The work's main objective was to extract and isolate a fraction rich in polysaccharides from the leaves of B. forficata, structurally characterize them and evaluate their contribution to hypoglycemic and antidiabetic activity in vivo and to anti-inflammatory activity in vitro. From the aqueous extract prepared with the leaves of the plant, two fractions were obtained: BFSF (BFSGD), supernatant from the freeze-thawing process at room temperature, and TCA-S, supernatant from the treatment of the BFSF fraction with trichloroacetic acid (TCA), with the purpose of deproteinization. In relation to the BFSF fraction, it presented an almost homogeneous elution profile in the homogeneity analysis by HPSEC-RI and in the analysis of spectrophotometric determinations it presented 50.4% of total sugars, 15.1% of proteins, and 15.0% of compounds phenolics contents. Analysis of monosaccharide composition by GC showed 27.4% arabinose, 23.7% galactose, 16.1% rhamnose, 13.8% glucose, 6.2% mannose, 2.5% xylose, 0.3% fucose and 10.0% galacturonic acid, the latter determined by colorimetric method. By NMR and methylation analysis, it was possible to conclude that the polysaccharides present in the BFSF fraction are homogalacturonan, arabinan, starch and types I and II arabinogalactans. The BFSF fraction, at doses of 10, 30, 100 and 300 mg/kg, was analyzed for its hypoglycemic potential through the animal model of streptozotocin-induced diabetes in rats. The acute (3 h) and chronic (21 days) effects of the fraction on the animals were evaluated. The fraction did not change blood glucose levels compared to the control group, treated only with saline, during the experiment. After the period of testing and euthanasia of the animals, blood was collected and biochemical and hematological analyzes were performed. Among the evaluated parameters, there was a statistical difference in the levels of conjugated bilirubin, with a decrease of 63.7% in the 10 mg/kg treated group and 54.6% in the 30 mg/kg group, and a decrease in of AST enzyme levels: the fraction at the dose of 10 mg/kg was able to reduce its concentration by 43.7% when compared to the control group. Histological liver studies demonstrated that the fraction, at doses of 30 and 100 mg/kg, was capable of significantly reducing the appearance and intensity of tissue injury, in 67.0% and 69.4%, respectively. These results indicate a hepatoprotective effect promoted by BFSF fraction. Regarding TCA-S fraction, it showed a homogeneous elution profile in HPSEC-RI, 81.6% of total sugars, 12.6% of phenolic compounds and 4.7% of total proteins and consists of 38.2% arabinose, 20.0% galactose, 17.6% rhamnose, 15.1% glucose, 6.3% mannose, 1.4% xylose and 1.3% galacturonic acid. NMR and methylation analyzes demonstrated that the fraction is mainly composed of types I and II arabinogalactans, arabinan and starch. The starch was removed from TCA-S through [alpha]-amylase treatment, and the starch-free fraction was renamed TCA-S [alpha]. The evaluation of the immunomodulatory potential of TCA-S [alpha], carried out using THP-1 cells, demonstrated that the fraction has immunostimulatory properties at concentrations 50, 100 and 500 [micrograms]/mL, by increasing all the cytokines quantified in the cell culture supernatant (TNF-[alpha], IL-1 [beta] and IL-10), and immunomodulatory effect in the presence of LPS, at a concentration of 50 [micrograms]/mL. The ratio between the concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines, stimulated by the positive control (LPS) and by TCA-S [alpha] plus LPS, was calculated for each concentration. The decrease in ratio values in all the concentrations of the TCA-S [alpha] + LPS group in comparison with LPS alone may suggest that the polysaccharide fraction has an immunomodulatory effect when simultaneously incubated with LPS.