Estratégias de bioimprinting aplicadas para melhoramento de propriedades catalíticas da lipase LipC12

Abstract

Resumo: A lipase LipC12 é uma enzima obtida de biblioteca metagenômica e que apresenta atividade e estabilidade em solventes orgânicos, além de ter sua estrutura previamente elucidada. Estudos prévios de imobilização e caracterização de LipC12 em meio orgânico se mostraram promissores, justificando este trabalho, que tem por objetivo geral desenvolver estratégias de bioimprinting aplicadas ao melhoramento das propriedades catalíticas de LipC12, como o aumento da atividade e de estabilidade (à temperatura e solventes orgânicos) da enzima. Foram conduzidos estudos da ativação de LipC12 e desenvolvidos protocolos de bioimprinting aplicados antes (prétratamento) ou depois da imobilização (pós-tratamento), utilizando diferentes agentes de bioimprinting, adotando protocolos já estabelecidos para a imobilização de LipC12 nos suportes comerciais Accurel MP-1000 (imobilização por adsorção) e Immobead 150-P (imobilização por ligação covalente), Constatou-se que a imobilização por adsorção somada ao bioimprinting não acarretou aumento da retenção da atividade e ainda ocorreram diminuições na eficiência de imobilização. Na imobilização por ligação covalente de LipC12 purificada, verificou-se que o melhor agente de bioimprinting foi o ácido oleico em t-butanol na razão de 147 nmol por 1 mg de LipC12 (AO5) com aumentos de atividade de LipC12 imobilizada de 828% para o pré-tratamento, 1210% para o pós-tratamento e de 180% no pós-tratamento feito em n-hexano. Para o extrato bruto de LipC12, houve aumento de 935% na atividade após o pré-tratamento com AO5 e 1355% no pós-tratamento com ácido oleico em t-butanol na razão de 29,4 nmol por 20 mg de proteína (AO1). Esses derivados imobilizados foram avaliados quanto à atividade de esterificação, constatando-se que LipC12 prétratada com AO5 apresentou ativação de 344%, equivalente 3,4 vezes o valor do controle (LipC12 imobilizada sem pré-tratamento), com atividade de esterificação de 290 U g -1, além de apresentar estabilidade de 100% após 10 ciclos de reuso em reações de hidrólise em meio orgânico. O aumento da atividade observado comprova a efetividade dos efeitos da técnica de bioimprinting aplicada.

Abstract: The LipC12 lipase is an enzyme obtained from a metagenomic library and that presents activity and stability in organic solvents, in addition to having its structure previously elucidated. Previous immobilization and characterization studies of LipC12 in organic media have shown promise, justifying this work, which has the general objective of developing bioimprinting strategies applied to improving the catalytic properties of LipC12, such as increasing activity and stability (at temperature and solvents). organic) of the enzyme. Studies of LipC12 activation were carried out and bioimprinting protocols applied before (pre-treatment) or after immobilization (post-treatment) were developed, using different bioimprinting agents, adopting already established protocols for the immobilization of LipC12 in the commercial supports Accurel MP-1000 (adsorption immobilization) and Immobead 150-P (covalent bond immobilization). In immobilization by covalent binding of purified LipC12, it was found that the best bioimprinting agent was oleic acid in t-butanol at a ratio of 147 nmol per 1 mg of LipC12 (AO5) with increases in activity of immobilized LipC12 from 828% to the pre-treatment, 1210% for the post-treatment and 180% for the post-treatment done in n-hexane. For the crude extract of LipC12, there was an increase of 935% in activity after pre-treatment with AO5 and 1355% after treatment with oleic acid in t-butanol at the rate of 29.4 nmol per 20 mg of protein (AO1). These immobilized derivatives were evaluated for esterification activity, showing that LipC12 pre-treated with AO5 showed activation of 344%, equivalent to 3.4 times the control value (immobilized LipC12 without pre-treatment), with esterification activity of 290 U g-1, in addition to presenting 100% stability after 10 cycles of reuse in hydrolysis reactions in organic medium. The observed increase in activity proves the effectiveness of the effects of the applied bioimprinting technique.