Efeito dos óleos essenciais de C. bergamia, C. X paradisi, limoneno e acetato de linalila contra endoparasitos de ruminantes : um olhar para motilidade, microscopia eletrônica de varredura e histoquímica

Abstract

Resumo: Endoparasitos gastrintestinais de ruminantes são responsáveis por perdas econômicas significativas e por afetar o bem-estar dos animais. O controle das infecções é realizado de forma inconsistente e a resistência destes nematodas aos fármacos comerciais constitui um desafio ao tratamento. Assim, alternativas advindas de plantas têm sido estudadas para agirem na redução das infecções. O objetivo deste trabalho foi estudar a atividade do óleo essencial de bergamota (OEB) e de grapefruit (OEG), além dos componentes (R)-limoneno e acetato de linalila (AL), sobre larvas infectantes (L3) de ovinos. A presente tese está dividida em Introdução, Revisão de literatura, Objetivos, seguidos de 4 capítulos e Considerações finais. O primeiro capítulo analisa a composição do OEB e sua atividade sobre a motilidade larval, isolado, na forma emulsificada, e em combinação com o nitroxinil (NTX) e ivermectina (IVM), que são fármacos comercialmente disponíveis. Também foi avaliada a ação de OEB sobre as larvas, através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e histoquímica utilizando reagente de Nadi. O OEB teve como componente majoritário (R)-limoneno (50,46%) e obteve eficácia máxima de 100% contra L3 (mortalidade acima de 90% de L3 em concentrações acima de 68,41 mg/ml). OEB apresentou atividade dependente da concentração. A combinação de OEB com NTX CL50 (200 ?L) apresentou atividade aditiva sobre OEB, com aumento de até 22% em relação ao OEB isolado. O OEB+IVM CL50 (300 ?L) apresentou atividade aditiva (aumento de até 45,3%), porém a combinação IVM+CL50 de OEB, teve atividade antagonista (redução de até 45,08%). As emulsões de OEB apresentaram formação de cremeação e foram consideradas micro-emulsões, tendo atividade de até 98,4% contra a motilidade das larvas. Não houve observação de alterações na epiderme das larvas de parasitos com a MEV. A histoquímica demonstrou presença de OEB em estruturas internas das L3 após testes de motilidade. No segundo capítulo, a composição química de OEG foi avaliada. O estudo da atividade de OEG e de (R)-limoneno sobre a motilidade das L3, e um comparativo entre a eficácia de ambos, também foram realizados. A atividade dos dois produtos vegetais também foi estudada quando em combinação com o NTX. A análise do OEG mostrou (R)-limoneno como constituinte principal (88,16%). Tanto OEG, quanto (R)-limoneno, apresentaram atividade contra a motilidade de L3 (100% e 93,8%, respectivamente). Ambas as eficácias foram dependentes da concentração. A eficácia de OEG foi maior em 40 e 80 ?l (33,7% e 20%, respectivamente) em relação ao (R)-limoneno. A combinação entre o OEG e NTX apresentou atividade aditiva do que o OEG isolado (aumento de até 19%). A combinação de (R)- limoneno com NTX, apresentou atividade antagonista (redução de até 55,8%) a partir da concentração de 10,93 mg/ml. No Capítulo 3 foi determinado efeito hormético do AL, sobre a motilidade de L3. Na concentração de 17,9 mg/ml, o AL apresentou eficácia de 100%. A partir da concentração de 17,9 mg/ml, observou-se diminuição da inibição de motilidade larval, caracterizando o efeito hormético do composto. O AL apresentou eficácia até 52,5% maior que o (R)-limoneno na mesma quantidade de composto testado (80 ?l). O desempenho do AL em relação ao (R)- limoneno foi maior até a concentração de 35,8 mg/ml, quando passou a ter menor eficácia. No Capítulo 4 está demonstrada a atividade de OEB, OEG e limoneno sobre Haemonchus contortus, que é a espécie mais agressiva de endoparasitos de ruminantes. Foi utilizado o isolado Kirby, originário da Austrália, sobre a eclosão de ovos e motilidade de L3 usando um Worm Micro Tracker. O OEB e o OEG influenciaram os controles positivos e negativos, quando incubados na mesma placa, comparados aos controles. Os três produtos testados, mostraram potencial antihelmíntico (89,1; 95,4 e 32,6%, respectivamente), contra este isolado em duas fases de seu ciclo de vida. Estudos aprofundados sobre os mecanismos de ação dos OEs e dos componentes isolados contra os endoparasitos são recomendados. A análise das atividades dos fitocomponentes sobre diferentes fases dos endoparasitos (ovos, L2 e adultos) e estudos in vivo também são indicadas para estudos futuros. Palavras-chave: Helmintos; Óleos essenciais; Cítricos; Limoneno; Acetato de linalila; Interação farmacológica; Histoquímica; Efeito hormético.

Abstract: Gastrointestinal endoparasites of ruminants are responsible for significant economic losses and for affecting animal welfare. Infection control is performed inconsistently and the resistance of these nematodes to commercial drugs is a challenge to treatment. Thus, alternatives from plants have been studied to act to reduce infections. The objective of this work was to study the activity of essential oil of bergamot (OEB) and grapefruit (OEG), in addition to the components (R) - limonene and linalyl acetate (AL), on infectious larvae (L3) of sheep. This thesis is divided into Introduction, Literature review, Objectives, followed by 4 chapters and Final considerations. The first chapter analyzes the composition of OEB and its activity on larval motility, isolated, in emulsified form, and in combination with nitroxinil (NTX) and ivermectin (IVM), which are commercially available drugs. The action of OEB on the larvae was also evaluated through scanning electron microscopy (SEM) and histochemistry using Nadi's reagent. OEB had the major component (R) -limonene (50.46%) and obtained a maximum effectiveness of 100% against L3. OEB showed concentration-dependent activity. The combination of OEB with NTX showed an additive activity over OEB, with an increase of up to 22% in relation to the isolated OEB. The OEB + IVM CL50 showed an additive activity (up to 45.3% increase), however the combination IVM + CL50 of OEB, had an antagonistic activity (reduction of up to 45.08%). The OEB emulsions showed creaming and were considered microemulsions, having an activity of up to 98.4% against larval motility. There was no observation of changes in the epidermis of parasite larvae with SEM. Histochemistry demonstrated the presence of OEB in internal structures of L3 after motility tests. In the second chapter, the chemical composition of OEG was evaluated. The study of the activity of OEG and (R) -limonene on the motility of L3, and a comparison between the effectiveness of both, were also carried out. The activity of the two plant products was also studied when in combination with NTX. The OEG analysis showed (R)-limonene as the main constituent (88.16%). Both OEG and (R)-limonene showed activity against L3 motility (100% and 93.8%, respectively). Both efficacies were dependent on concentration. The efficacy of OEG was greater by 40 and 80 ?l (33.7% and 20%, respectively) compared to (R) -limonene. The combination between OEG and NTX showed an additive activity than OEG alone (up to 19% increase). The combination of (R)-limonene with NTX, showed an antagonistic tendency (reduction of up to 55.8%) from the concentration of 10.93 mg / ml. In Chapter 3, the hormetic effect of AL on L3 motility was determined. At a concentration of 17.9 mg / ml, AL was 100% effective. From this concentration, there was a decrease in the inhibition of larval motility, characterizing the compound's hormetic effect. AL showed efficacy up to 52.5% higher than (R)-limonene in the same amount of compound tested (80 ?l). The performance of LA in relation to (R)-limonene was higher until the concentration of 35.8 mg / ml, when it became less effective. Chapter 4 shows the activity of OEB, OEG and limonene on Haemonchus contortus, which is the most aggressive species of ruminant endoparasites. The Kirby isolate, originally from Australia, was used on egg hatching and L3 motility using a Worm Micro Tracker. The OEB and OEG influenced the positive and negative controls, when incubated on the same plate, compared to the controls. The 3 products tested showed anthelmintic potential (89.1%; 95.40% and 32.61%, respectively) against this isolate in two phases of its life cycle. In-depth studies on the mechanisms of action of OEs and isolated components against endoparasites are recommended. The three products tested showed anthelmintic potential against this isolate in two phases of its life cycle. Analyzes of phytocomponent activities on different phases of endoparasites (eggs, L2 and adults) and in vivo studies are also indicated in the future. Keywords: Endoparasites. Citrus essential oils. Limonene. Linalyl acetate. Combinations. Nadi reagent. Hormetic effect.