Avaliação do uso de fosfolipases-D mutadas recombinantes no tratamento e prevenção do loxoscelismo

Abstract

Resumo: Acidentes com aranhas do gênero Loxosceles causam loxoscelismo, um problema de saúde pública em diversos países. Só no Brasil, em 2022 foram notificados 6.686 casos e 8 óbitos decorrentes desses acidentes. A soroterapia, que utiliza anticorpos policlonais produzidos em cavalos imunizados com veneno bruto, é o único tratamento específico para inativar as toxinas do veneno. Dentre todas as toxinas presentes no veneno, as Fosfolipases D (FLDs) destacamse por conseguirem reproduzir experimentalmente a maioria dos sinais e sintomas do loxoscelismo. Portanto, o presente estudo concentrou-se em avaliar as FLDs mutadas recombinantes como antígenos para a produção de uma vacina. Coelhos vacinados com 2 ou 3 doses apresentaram proteções similares frente ao loxoscelismo cutâneo, independente da massa de FLDs utilizada durante as imunizações. Ainda, camundongos vacinados com 3 doses apresentaram proteção de 80% frente à letalidade induzida pelo veneno. Proteção superior à de animais vacinados com 2 ou 1 dose, 50% e 40% de proteção, respectivamente. A quantidade de IgG circulante, mensurada através do ensaio de ELISA, também foi significativamente maior em camundongos e coelhos que receberam reforço vacinal, não houve diferença entre animais que receberam o mesmo número de doses mas massas diferentes de FLDs. Em conjunto, esses resultados indicam que o número de doses exerce mais influência na eficácia frente ao loxoscelismo cutâneo e sistêmico do que a massa de antígenos usadas na vacinação, indicando que a quantidade de anticorpos circulantes pode ser a chave para um desfecho melhor do acidente. Ainda, ensaios in vitro demonstraram que anticorpos produzidos contra as FLDs apresentaram capacidade de neutralizar a atividade esfingomielinásica dos venenos de Loxosceles, um dos fatores chaves para a fisiopatologia do envenenamento. Além disso, o bloqueio da ação das FLDs nativas do veneno também demonstrou ser relevante em proteger camundongos das ações nefrotóxicas do veneno. Em comparação com animais não vacinados, os animais vacinados não apresentaram proteinúria, glicosúria, alteração na quantidade de ureia sérica e apresentaram apenas alterações histológicas renais brandas. Portanto, o trabalho avança na compreensão dos mecanismos chaves para a produção de uma vacinação efetiva frente ao loxoscelismo.

Abstract: Spider accidents of the Loxosceles genus cause loxoscelism, a public health problem in several countries. In Brazil alone, in 2022, 6,686 cases and 8 deaths resulting from these accidents were reported. Serum therapy, which uses polyclonal antibodies produced in horses immunized with crude venom, is the only specific treatment to neutralize the venom toxins. Among all toxins present in the venom, Phospholipases D (PLDs) stand out for being able to experimentally reproduce most signs and symptoms of loxoscelism. Therefore, the present study focused on evaluating recombinant mutated PLDs as antigens for vaccine production. Rabbits vaccinated with 2 or 3 doses showed similar protections against cutaneous loxoscelism, regardless of the mass of PLDs used during immunizations. Moreover, mice vaccinated with 3 doses showed 80% protection against venom-induced lethality, superior to animals vaccinated with 2 or 1 dose, 50% and 40% of protection, respectively. The amount of circulating IgG, measured through ELISA assay, was also significantly higher in mice and rabbits that received booster vaccination, with no difference between animals that received the same number of doses but different masses of PLDs. Taken together, these results indicate that the number of doses has more influence on efficacy against cutaneous and systemic loxoscelism than the mass of antigens used in vaccination, suggesting that the amount of circulating antibodies may be the key to a better outcome of the accident. Furthermore, in vitro assays demonstrated that antibodies produced against PLDs showed the ability to neutralize the sphingomyelinase activity of Loxosceles venoms, one of the key factors in the pathophysiology of poisoning. Additionally, blocking the action of native PLDs in the venom also proved to be relevant in protecting mice from the venom's nephrotoxic actions. Compared to unvaccinated animals, vaccinated animals showed no proteinuria, glycosuria, alteration in the quantity of serum urea, and only mild renal histological changes. Therefore, the study advances in understanding the key mechanisms for the production of an effective vaccination against loxoscelism.