Caracterização funcional do sistema PTSNtr de Escherichia coli

Abstract

Resumo: Além do sistema de fosfotransferase de carboidratos (PTS de carboidratos) dedicado à absorção de carboidratos, muitas bactérias Gram-negativas possuem o chamado PTS do metabolismo de nitrogênio (PTSNtr). O PTSNtr regula diversos processos implicados no metabolismo de nitrogênio e carbono, e é essencial para a virulência em algumas bactérias. Além disso, desempenha um papel na homeostase do potássio regulando a expressão e a atividade de um transportador de K+ de alta e baixa afinidade, respectivamente. O estado de fosforilação do EINtr é regulado por glutamina e 2-oxoglutarato, metabólitos cujos níveis intracelulares refletem o status de nitrogênio. Inicialmente, no intuito de compreender como o sistema PTSNtr de E. coli regula o metabolismo de nitrogênio realizaram-se estudos com uma abordagem proteômica. Os resultados indicam que o mutante de E. coli ?ptsN tem o crescimento mais lento em meio mínimo. A análise proteômica da linhagem ?ptsN sob limitação e excesso de nitrogênio não revelou envolvimento na regulação do sistema canônico regulador de nitrogênio (Ntr). Os dados proteômicos suportam a conclusão de que o EIIANtr é necessária para equilibrar as atividades dos fatores sigma RpoS e RpoD de tal forma que, na ausência do gene ptsN, os genes dependentes de RpoS tem maior abundância. Na sequência, visando caracterizar funcionalmente o sistema PTSNtr de E. coli, foi aplicada uma ferramenta de ligand fishing associada a uma abordagem proteômica labelfree. Buscaram-se por novos alvos de interação da proteína EIIANtr e de uma variante que mimetiza sua fosforilação (EIIANtr-H73D). Os resultados apontam que EIIANtr interage com proteínas da via de quimiotaxia e proteínas do metabolismo central. Tais dados sugerem um papel regulador do sistema PTSNtr como um sensor de disponibilidade de nutrientes e um regulador do desvio das vias dependendo do estado nutricional do ambiente. Ntr canônico compreende uma intricada rede reguladora centrada na ação das proteínas PII e, responde aos mesmos sinais que PTSNtr. Baseado em um estudo realizado por Gerhardt (2015), que buscou novos alvos de proteínas PII de Azospirillum brasilense, foi identificada a proteína TrkA, que regula a atividade do transportador de potássio Trk como provável ligante de PII. Os dados indicam que o complexo PII-TrkA é inibido por níveis fisiológicos relevantes de 2-OG na presença de MgATP. Além disso, o complexo TrkA-PII é sensível à razão ATP: ADP. Estes dados sugerem que as proteínas PII podem ser capazes de regular a atividade de transporte de Trk.

Abstract: In addition to the sugar phosphotransferase (PTS sugar) system dedicated to carbohydrate transport and phosphorylation, many gram-negative bacteria have the alternative PTS of nitrogen the metabolism (PTSNtr). The PTSNtr regulates several processes involved in the metabolism of nitrogen and carbon and is essential for virulence in some bacteria. In addition, it plays a role in potassium homeostasis by regulating the expression and activity of a high and low affinity K+ transporter, respectively. The phosphorylation state of EINtr is regulated by glutamine and 2-oxoglutarate, metabolites whose intracellular levels reflect the nitrogen status. In order, we applied a proteome approch to understand how the PTSNtr system of E. coli regulates the nitrogen metabolism. The results indicate that the E. coli ?ptsN mutant has the slowest growth in minimal medium. The proteomic analysis of the ?ptsN strain under nitrogen limitation and excess did not show any involvement in the regulation of the canonical nitrogen regulator system (Ntr). Proteomic data support the conclusion that EIIANtr is required to balance the activities of RpoS and RpoD sigma factors such that, in the absence of the ptsN gene, RpoS-dependent genes have greater abundance. In order to characterize the E. coli PTSNtr functionally, a ligand fishing tool associated with a labelfree proteomic approach was applied. We searched for new interaction targets of the EIIANtr protein and of a variant that mimics its phosphorylation (EIIANtr-H73D). The results indicate that EIIANtr interacts with chemotaxis pathway proteins and central metabolic proteins. These data suggest a regulatory role for the PTSNtr system as a nutrient availability sensor and a pathway regulator depending on the nutritional status of the environment. Ntr canonical comprises an intricate regulatory network centered on the action of PII proteins and responds to the same signals as PTSNtr. Based on a study by Gerhardt (2015), which sought new targets of PII proteins of Azospirillum brasilense, the TrkA protein was identified, which regulates the activity of the Trk potassium transporter as a probable PII ligand. The data indicate that the PII-TrkA complex is inhibited by relevant physiological levels of 2-OG in the presence of MgATP. In addition, the TrkA-PII complex is sensitive to the ATP: ADP ratio. These data suggest that PII proteins may be able to regulate Trk transport activity.