Aspectos ultraestruturais da germinação, localização da atividade da fosfatase acida e avaliação estrutural da fração micosporina em conídios de Colletotrichum graminicola

Abstract

Resumo: Conídios não germinados de Colletotrichum graminicola, fungo patógeno de milho, exibem grande número de corpos lipídicos no citoplasma. A atividade da fosfatase ácida presente no homogenato de conídios não germinados foi caracterizada. A enzima apresenta pH ótimo 5,5 e Km para p-nitrofenilfosfato igual à 0,631 mM. A atividade da fosfatase ácida aumenta com o envelhecimento dos conídios, concomitantemente com a diminuição dos lipídios armazenados. Testes citoquímicos ultraestruturais mostraram o produto da reação citoquímica da fosfatase ácida, fosfato de cério, nos vacúolos de C. graminicola, o que sugere atividade lítica nestes compartimentos. Usando o produto de reação associado à face interna da membrana vacuolar como marcador de membrana, observa-se que os corpos lipídicos são internalizados pelos vacúolos em um processo análogo à microautofagia. As análises ultraestruturais sugerem que os lipídios captados são digeridos no interior do vacúolo. De maneira semelhante, outras estruturas citoplasmáticas são englobadas pelos vacúolos. Os conídios germinam e penetram na membrana de celofane, estabelecendo um modelo para o estudo do processo germinativo através de microscopia eletrônica de transmissão. Os corpos lipídicos desaparecem do conídio germinado e os vacúolos aumentam, simultaneamente com a deposição do produto de reação da fosfatase ácida. O apressório apresenta atividade da fosfatase ácida em múltiplas vesículas heterogêneas, a maioria justapostas aos corpos lipídicos. O apressório também secreta fosfatase ácida. Os conídios não germinados foram submetidos à extração e isolamento de micosporina. A extração com metanol seguida de cromatografia em DEAE-Sephadex A-50 e em Sephacryl S-200 produziu uma fração heterogênea. O espectro de UV foi consistente com a presença de micosporina. O conjunto das análises monodimensionais de 13C-RMN, 1H-RMN e bidimensionais COSY, TOCSY, HMQC e HMBC sugerem a estrutura micosporina-glutamina como principal composto presente na fração isolada. Os deslocamentos químicos atribuídos aos carbonos da estrutura são similares aos descritos na literatura para esta classe de compostos. Estes resultados estão em concordância com as análises de FTIR e ESI-MS. A fração isolada não tem efeitos sobre a germinação de conídios com 15 dias.

Abstract: Ungerminated conidia of Colletotrichum graminicola, a pathogen of sorghum and com, exhibited a large number of lipid bodies stored in their cytoplasm. The acid phosphatase activity of the homogenate obtained from the ungerminated conidia was characterized. It has an optimum pH of 5.5 and the Km for p-nitrophenylphosphate is 0.631 mM. During aging the acid phosphatase activity increases and the lipids stored, in the cytoplasm decrease. Cytochemical ultrastructural tests showed that ungerminated conidia vacuoles contain the cytochemical reaction product of the acid phosphatase, cerium phosphate, which is suggestive of lytic activity. The reaction product is associated with the internal face of the vacuole membranes. Using this product as a marker of the vacuole membrane, the lipid bodies were shown to be internalized by vacuoles in a process analogous to microautophagy. In this process, the vacuoles internalize and digest lipid bodies. Similarly, diversified cytoplasmic structures were internalized by vacuoles. The conidia are capable of germination and penetration into the cellophane membrane, establishing a model for the study of the germinative process, using transmission electron microscopy. The lipid bodies disappeared from the germinated conidia and the vacuoles enlarged concomitantly with deposition of the product of the acid phosphatase reaction. Appressoria also showed acid phosphatase activity in multiple heterogeneous vesicles. A number of these were juxtaposed with lipid bodies. In addition, appressoria secreted acid phosphatase. The ungerminated conidia were also extracted and the mycosporin isolated, as follows. Extraction was effected with methanol and the extract submitted to chromatography through DEAE-Sephadex A-50 followed by Sephacryl S-200. This methodology produced a heterogeneous fraction. Its UV spectrum was consistent with that of mycosporin. One-dimensional 13C-RMN, ^-R M N and two-dimensional COSY, TOCSY, HMQC and HMBC analyses suggested a mycosporin-glutamine structure as a main component of the isolated fraction. These results were consistent with the FTIR and ESI-MS analyses. The isolated fraction did not have any effect on germination of conidium 15 day old.