Caracterização fenotípica e molecular de isolados de Clostridiodes difficile circulantes em instituições de Curitiba e avaliação dos métodos de detecção
Resumo
Resumo: A infecção por Clostridioides difficile (ICD) é uma causa comum de diarreia induzida por antibióticos em adultos, com impacto significativo na morbidade e nos custos de saúde. No entanto, há uma escassez de estudos sobre a epidemiologia e diagnóstico da ICD em hospitais brasileiros. A falta de um teste único e preciso para o diagnóstico laboratorial levou as entidades internacionais recomendarem algoritmos de testes para melhorar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico. Poucos estudos foram realizados em países em desenvolvimento para determinar se esses métodos são aplicáveis à sua realidade. Este estudo teve como objetivo avaliar os métodos de diagnóstico laboratorial disponíveis e caracterizar fenotipicamente e genotipicamente as cepas de C. difficile em diferentes instituições de saúde em Curitiba. O estudo analisou 456 amostras de fezes diarreicas de adultos e crianças, das quais 76 (16,7%) foram classificadas como ICD. As amostras foram avaliadas por meio de testes imunoenzimáticos (EIE), amplificação de ácidos nucleicos (NAAT) e cultura toxigênica. Essas amostras foram utilizadas para validação de uma qPCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real) in house, e posteriormente para avaliar o desempenho de qPCR e outros métodos comerciais disponíveis para o diagnóstico laboratorial da ICD. Os melhores resultados foram obtidos com o algoritmo de duas etapas com a Glutamato desidrogenase (GDH) por EIE associado a qPCR comercial, seguido da qPCR comercial sozinha, com acurácia 94,5% e 94,2%, respectivamente. Em uma análise retrospectiva de 12 anos, foi observado que o uso de um teste de triagem de alta sensibilidade (GDH/EIE) seguido por um teste de alta especificidade (qPCR) aumentou o diagnóstico de ICD no principal hospital do estudo. Todos os isolados de C. difficile obtidos em cultura foram sensíveis ao metronidazol e vancomicina. Entre os isolados, 39 foram submetidos ao sequenciamento do genoma completo e avaliados quanto ao tipo de sequência (ST), genes de virulência e genes de resistência O ST42 foi o mais predominante nas amostras de crianças e adultos. Além das toxinas A, B e toxina binária, foram encontrados genes relacionados à aderência e formação de esporos. Alguns isolados também apresentaram genes de resistência à vancomicina. Os dados clínicos obtidos de adultos foram apresentados em um estudo anterior. Em relação às crianças, foi observado que aquelas com histórico prévio de ICD e presença de muco nas fezes apresentaram maior probabilidade de desenvolver a doença. O tratamento mais comum utilizado foi o metronidazol, com uma taxa de cura completa de 76,9% e uma taxa de recidiva de 23,1%. Este estudo forneceu informações sobre a diversidade nos genes de virulência e resistência, bem como nas cepas circulantes de C. difficile. O algoritmo de duas etapas foi considerado o método diagnóstico mais eficiente. C. difficile foi identificado como um patógeno importante em crianças com diarreia. São necessários mais estudos longitudinais para avaliar os fatores do hospedeiro, dados clínicos relevantes e dados moleculares, a fim de obter uma melhor compreensão da ICD associada à diarreia nos sistemas de saúde. Abstract: Clostridioides difficile infection (CDI) is a common cause of antibiotic-induced diarrhea in adults, with significant impact on morbidity and healthcare costs. However, there is a shortage of studies on the epidemiology and diagnosis of CDI in Brazilian hospitals. The lack of a single accurate test for laboratory diagnosis has led international entities to recommend test algorithms to improve sensitivity and specificity of diagnosis. Few studies have been conducted in developing countries to determine if these methods are applicable to their reality. This study aimed to evaluate available laboratory diagnostic methods and phenotypically and genotypically characterize C. difficile strains in different healthcare institutions in Curitiba. The study analyzed 456 samples of diarrhea stools from adults and children, of which 76 (16.7%) were classified as ICD. The samples were evaluated through enzyme immunoassays (EIA), nucleic acid amplification tests (NAAT) and toxigenic culture. These samples were used for the validation of an in-house real-time polymerase chain reaction (qPCR) and subsequently to assess the performance of qPCR and other commercially available methods for the laboratory diagnosis of CDI. The best results were obtained with the two-step algorithm using Glutamate dehydrogenase (GDH) by EIA combined with commercial qPCR, followed by commercial qPCR alone, with accuracies of 94.5% and 94.2%, respectively. In a 12-year retrospective analysis, it was observed that the use of a high sensitivity screening test (GDH/EIA) followed by a high specificity test (qPCR) increased the diagnosis of CDI at the main hospital in the study. All C. difficile isolates obtained in culture were sensitive to metronidazole and vancomycin. Among the isolates, 39 were subjected to whole genome sequencing and evaluated for sequence type (ST), virulence genes, and resistance genes. ST42 was the most predominant in samples from children and adults. In addition to toxins A, B, and binary toxin, genes related to adherence and sporulation were found. Some isolates also carried vancomycin resistance genes. Clinical data obtained from adults were presented in a previous study. About children, it was observed that those with a previous history of ICD and presence of mucus in their stool had a higher likelihood of developing the disease. The most common treatment used was metronidazole, with a complete cure rate of 76.9% and a recurrence rate of 23.1%. This study provided information on the diversity in virulence and resistance genes, as well as in circulating strains of C. difficile. The two-stage algorithm was considered the most efficient diagnostic method. C. difficile was identified as an important pathogen in children with diarrhea. More longitudinal studies are needed to evaluate host factors, relevant clinical data, and molecular data to gain a better understanding of CDI associated with diarrhea in healthcare systems.
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