Contribuição ao conhecimento do mecanismo de ação dos compostos 1,3,4 - tiadiazois mesoionicos

Abstract

Resumo: Os compostos mesoiônicos apresentam potencial aplicação terapêutica, devido às suas propriedades químicas. Suas regiões de cargas positiva e negativa, associadas a um sistema aromático poliheteroatômico, favorecem a interação destes compostos com biomóleculas. Por outro lado, a ausência de uma carga líquida facilita a sua passagem através de membranas biológicas. Neste estudo, foram investigados os efeitos de um novo composto mesoiônico, o cloreto de 4-fenil-5-(4-nitrocinamoil)-1,3,4-tiadiazólio-2-fenilamina (Ml-D) para o qual foi descrita uma importante ação antitumoral. O Ml-D promove, em fígado de rato alimentado, a inibição no consumo de oxigênio, o estímulo da glicogenólise e uma discreta inibição da glicólise, conforme o demonstrado pelos valores diminuídos de lactato e piruvato. Verificou-se que o Ml-D reduz a eficiência da fosforilação oxidativa em mitocôndrias isoladas de fígado de rato. As análises dos complexos da cadeia respiratória sugerem que o alvo de inibição do composto mesoiônico situa-se após o complexo I e entre os complexos II e III. O Ml-D promove o colapso do potencial elétrico de membrana (DeltaPsi). A atividade da enzima ATPase foi drasticamente aumentada em presença do Ml-D em mitocôndrias intactas, mas inibida em mitocôndria desacopladas com FCCP. O Ml-D altera a fluidez e a elasticidade da membrana mitocondrial interna, conforme o verificado nos ensaios de inchamento mitocondrial em presença de acetato de sódio, de K+ mais valinomicina e K+ mais nigericina. Os resultados dos estudos de polarização de fluorescência das sondas DPH e DPH-PA em vesículas multilamelares sintéticas (DMPC) e naturais, sugerem que o Ml-D se instala na membrana mitocondrial diminuindo sua fluidez, afetando tanto os centros hidrofóbicos, monitorados pela sonda DPH, quanto a região externa, mais hidrofílica, monitorada pela sonda DPH-PA. Verificou-se que em células HeLa e L1210, o Ml-D estimula o consumo de oxigênio do estado IV induzido por oligomicina, e, ainda em células L1210, o composto mesoiônico estimulou a produção de lactato. A monocamada de células HeLa tratadas com o Ml-D apresenta alterações morfológicas, características do processo de morte celular por apoptose, a saber: a) formação de blebs na membrana plasmática; b) condensação da cromatina e c) fragmentação do núcleo. A confirmação do Ml-D como indutor de apoptose foi realizada através de ensaios utilizando o método de TUNEL. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o Ml-D atua como um agente desacoplador inibitório, induz a morte celular por apoptose e, sugere, ainda, que tal mecanismo possa ser responsável pelo efeito antitumoral deste composto.

Abstract: Mesoionic compounds possess structural features which confer on them potential biological activity and pharmaceutical use. Their structures, with well separated regions of positive and negative charges, associated with a polyheteroatomic system, enable them to interact with biomolecules. Although the compounds are internally charged, they are overall electrically neutral, enabling them in vivo to cross the biological membranes. In this investigation we studied the effects of a hitherto not examined mesoionic compound, Ml-D (4- phenyl-5-(4-nitrocinnamoyl)-1,3,4-thiadiazolium-2-phenylamine chloride) for which has been demonstrated to have an important anti-tumoral effect. Ml-D infusion in livers from well-fed rats inhibits oxygen consumption, stimulates glycogenolysis, and promotes a discreet inhibition of glycolysis, according to a decrease in production of lactate and pyruvate. It also depresses the phosphorylation efficiency of liver mitochondria as indicated by accentuated decreases of the respiratory control coefficient and ADP/O ratio. Analysis of segments of the respiratory chain suggests that the Ml-D inhibition site is after complex I and between complex II and III. The electrical potential (DeltaPsi) is collapsed depending on Ml-D concentration. ATPase activity is dramatically increased by action of Ml-D in intact mitochondria, but inhibited in FCCP - uncoupled mitochondria. Ml-D interferes with inner mitochondrial membrane fluidity and elasticity, as demonstrated by assays of mitochondrial swelling in the presence of sodium acetate, valinomycin + K+ and nigericin + K+. In order to evaluate the effects of Ml-D on membrane fluidity artificial DMPC membranes and native mitochondrial membranes were used. The effect of Ml-D on the fluorescence polarization of DPH, probing the bilayer core, and of its anionic propionic acid derivative, DPH-PA, probing the outer regions of the bilayer, in DMPC bilayers and in native membranes were investigated. The results suggest that Ml-D shifts the midpoint of phase transition to higher values and that the mesoionic compound orders the fluid phase of both preparations of the lipid, either in the hydrophobic core or in the outer regions of the bilayer. In HeLa and L1210 cells, Ml-D inhibits oxygen consumption sustained by endogenous substrates, but when the respiration was inhibited by oligomycin, it promoted an accentuated stimulus. The glycolysis of L1210 cells was highly increased by action of Ml-D. HeLa monolayers treated with Ml-D presented the morphological alterations characteristic of cellular death by apoptosis as shown by the appearance of cytoplasmatic blebs; nuclear chromatin condensation and nuclear fragmentation. Confirmation that Ml-D acts as an inducer of apoptosis was obtained by specific labeling of DNA fragmentation by a TUNEL assay. The results presently obtained enable us to classify Ml-D as a new inhibitory uncoupling agent, able to induce cell death by apoptosis and suggest that mechanisms of such actions can be involved in its anti-tumoral effect.