Alterações na conformação da cromatina de celulas de Sertoli causadas por tratamento com retinol

Abstract

Resumo: Com o objetivo de solucionar questões surgidas durante o desenvolvimento de vários trabalhos em nosso grupo de pesquisa decidimos averiguar os possíveis efeitos do retinol sobre a conformação da cromatina em células de Sertoli cultivadas. Foram isoladas células de Sertoli de ratos Wistar de 15 dias de vida e mantidas em cultura. Estas culturas eram tratadas com retinol 10 mM por 6h, 24h e 48 h; seis horas antes do final destes períodos de incubação as culturas recebiam 32P na concentração de 10 µCi/ml. As histonas e HMGs destas células eram então isoladas, quantificadas e contadas em cintilador líquido. As amostras destas proteínas foram submetidas separação eletroforética para determinarmos os efeitos do retinol sobre o padrão de fosforilação das proteínas nucleares como um todo e os efeitos sobre cada sub-família de histonas ou HMGs. Os resultados indicaram que o retinol alterava o padrão de fosforilação das proteínas nucleares e que esta alteração se modificava com o tempo de tratamento. Para que fosse esclarecida qual a consequência destas alterações nos padrões de fosforilação das proteínas nucleares sobre a conformação da cromatina decidimos realizar alguns testes descritos na literatura. Submetemos a cromatina das células de Sertoli ação da DNAse tipo I 20 U/mg de DNA por 30 minutos, e verificamos que a cromatina das células tratadas com retinol era sempre mais sensível ação desta enzima que a de células não tratadas. Estes resultados indicavam que a cromatina das células tratadas estava mais relaxada ou que havia danos na estrutura do DNA; decidimos averiguar estas duas possibilidades. A sensibilidade da cromatina das células de Sertoli, tratadas e controle, ação da DNAse tipo I, foi testada na presença de 1,10 fenantrolina, um quelante de Fe (II), pois desta maneira impediríamos o acontecimento da reação de Fenton nestas células, uma das reações responsáveis pelo surgimento de radicais .OH nas células. Com este tratamento, a sensibilidade aumentada da cromatina das células tratadas desapareceu, indicando a presença de danos na estrutura do DNA pelo tratamento com retinol. Para averiguarmos se havia simultaneamente também a síntese específica de x v ii algum gene ativado pelo stress oxidativo da célula, decidimos determinar os efeitos do tratamento com retinol sobre a incorporação de [3H] timidina pela cromatina, na presença ou ausência de um inibidor de síntese de DNA, a hidroxi-uréia 3 mM, por 2 horas. Estes experimentos sugerem que existe simultaneamente ao reparo, a indução e a alplificação de alguns genes. Por fim como uma maneira de testarmos nossas hipóteses, decidimos verificar a atividade da enzima Omitina descarboxilase nas células tratadas. Estes experimentos indicaram que o tratamento com retinol afeta a atividade desta enzima que se toma mais ativa que a das células controle depois de 24 horas de tratamento, fenômeno este que parece estar associado com a inibição de processos celulares que levem proliferação antes que o material genético da célula esteja completamente reparado.