Biologia sintética aplicada a produção heteróloga de citocininas em sistemas bacterianos

Abstract

Resumo: Citocininas são fitohormônios que atualmente possuem aplicação na área de biotecnologia vegetal, como micropropagação de plantas e produção de metabólitos secundários vegetais. Além disso, citocininas possuem potencial de uso como promotores de crescimento vegetal, uma vez que regulam diversos aspectos de interesse agroindustrial como o aumento da produtividade de grãos, frutas e biomassa, a nodulação de leguminosas e a resistência à stress de origem abiótica e de origem biológica. Entretanto, a produção desses fitohormônios é cara, seja por síntese química, seja por extração de tecidos vegetais, cuja concentração está na faixa de pmol/g de massa fresca. O presente trabalho propõe a expressão de genes de vias de biossíntese de citocininas, como o gene ipt4a que codifica a isopentenil adenilato transferase 4v de Arabidopsis thaliana e o gene tmr que codifica a isopentenil ou dimetilalil transferase de Agrobacterium tumefaciens, em E. coli MG1655 para produzir citocininas de forma heteróloga. Usando um sistema de detecção baseado em um receptor de citocininas de planta (AHK4) expresso por uma bactéria sensora (E. coli KMI001) que expressa ß-galactosidases induzida por citocininas, detectou-se a presença desse fitohormônio tanto no sobrenadante dos cultivos quanto no citosol de bactérias recombinantes expressando as enzimas Tmr e Ipt4. Descobriu-se que enzimas intracelulares da bactéria interagem com as citocininas produzidas pela reação enzimática das enzimas Tmr e Ipt4, o que as tornam detectáveis ao sistema de detecção por bactéria sensora e permite que sejam excretadas para o sobrenadante. Também realizaram-se cultivos de células vegetais de tomate (Solanum lycopersicum) e observou-se a formação de calo quando o citosol das bactérias recombinantes foi usado como substituto à citocinina sintética BAP, demonstrado que a citocinina produzida pelas bactérias recombinantes possui atividade biológica. Esse trabalho tem como perspectivas identificar e purificar a citocinina produzida pelas bactérias desenvolvidas nesse trabalho, assim como testar a atividade biológica do sobrenadante dessas bactérias em plantas, e transferir o sistema de produção de citocininas para bactérias promotoras de crescimento vegetal como Azospirillum brasilense FP2.

Abstract: Cytokinins are phytohormones that currently have application in plant biotechnology, such as plant micropropagation and production of plant secondary metabolites. In addition, cytokinins can be used as plant growth promoters since they regulate several aspects of agro-industrial interest such as increasing grain, fruit and biomass productivity, legume nodulation and resistance to abiotic and biological stress. However, producing these phytohormones is expensive, either by chemical synthesis or by extraction of plant tissues, whose concentration is in the range of pmol/g of fresh mass. The present work proposes expression of cytokinin biosynthesis pathways genes, such as the IPT4a gene that encodes isopentenyl adenylate transferase 4v from Arabidopsis thaliana and the tmr gene that encodes isopentenyl or dimethylallyl transferase from Agrobacterium tumefaciens in E. coli MG1655 for heterologous cytokinin production. Using a detection system based on plant cytokinin receptor (AHK4) expressed by sensing bacterium (E. coli KMI001) that expresses cytokinin-induced ß-galactosidase, the presence of this phytohormone was detected both in culture supernatant and in the cytosol of recombinant bacteria expressing the enzymes Tmr and Ipt4. It was discovered that intracellular enzymes of these bacteria interact with cytokinins produced by enzymatic reaction of the enzymes Tmr and Ipt4, which makes them detectable to the detection system by sensor bacteria and allows these molecules to be excreted into the supernatant. Tomato (Solanum lycopersicum) plant cells were also cultivated, and callus formation was observed when cytosol of the recombinant bacteria was used as a substitute for synthetic cytokinin BAP, demonstrating that cytokinins produced by recombinant bacteria have biological activity. This work aims to identify and purify the cytokinins produced by the bacteria developed in this work, test the biological activity of supernatant of these bacteria in plants, and transfer the cytokinin production system to plant growthpromoting bacteria such as Azospirillum brasilense FP2.