Teste molecular para uso na rede de saúde pública : desenvolvimento de protocolo simplificado de extração de DNA e otimização da qPCR em plataforma portátil para auxílio no diagnóstico de hanseníase
Resumo
Resumo: A hanseníase tem como principal método diagnóstico a análise clínica. Esta por sua vez carece em sensibilidade assim como os exames complementares. A técnica molecular de qPCR por ter elevada sensibilidade e especificidade é capaz de superar algumas das limitações inerentes ao diagnóstico da patologia. No entanto, por exigir investimentos em insumos e infraestrutura laboratorial, se restringe aos grandes centros. Esse cenário corrobora o subdiagnóstico e a negligência da doença principalmente em populações de vulnerabilidade social. O objetivo deste estudo foi otimizar as reações de qPCR utilizando oligonucleotídeos do primeiro kit nacional de diagnóstico molecular para hanseníase, em uma plataforma portátil (Q3-Plus), além de avaliar métodos minimamente invasivos para coleta de amostras e desenvolver um protocolo simplificado para extração de DNA que atenda ao conceito point-of-care. Na otimização das reações no Q3-Plus, foram estabelecidos parâmetros ópticos, threshold e cutoff para os alvos 16S rRNA e RLEP do M. leprae, utilizando amostras de DNA sintético, DNA purificado de M. leprae e amostras clínicas pré-caracterizadas. A avaliação de técnicas minimamente invasivas de coleta foi realizada através de tape-strip e microagulhamento em regiões próximas ao nervo ulnar de voluntários saudáveis, com análise por qPCR para amplificação do alvo 18S rRNA de mamíferos. Os resultados mostraram baixa recuperação de DNA. Portanto, optou-se por avaliar apenas as amostras de biópsia de pele no Q3-Plus pois são consideradas as mais sensíveis para o diagnóstico da hanseníase. Para a extração simplificada de DNA a partir de amostras de pele, foram testadas diferentes soluções de lise, empregando agentes caotrópicos como ureia, guanidina e hidróxido de amônio. A etapa de purificação foi realizada depositando-se o material lisado em cartões FTA e com avaliação de diferentes métodos de eluição. A avaliação final dos protocolos de extração foi realizada por qPCR para amplificação do alvo 18S rRNA de mamíferos, utilizando pele suína como modelo comparativo. Entre as soluções avaliadas, observou-se menor dissolução do fragmento de pele nos protocolos com guanidina, enquanto a solução com ureia apresentou a melhor dissolução do fragmento de pele e menor valor de Cts, indicando maiores concentrações de DNA. Após determinar o melhor protocolo, a metodologia completa (extração simplificada + qPCR na plataforma portátil) foi avaliada em amostras clínicas de biópsia de pele précaracterizadas e comparadas com o equipamento padrão (Quantstudio-5). As reações otimizadas no Q3-Plus apresentaram eficiência de 131.06% para o alvo 16S rRNA e 104.65% para RLEP, utilizando amostra e DNA purificado de M. leprae. Quanto à sensibilidade analítica, as reações no equipamento alcançaram 113.23 genomasequivalentes/ ?L para o gene 16S rRNA e 19.72 genomas-equivalentes/?L para RLEP. Os valores de sensibilidade do teste para a detecção de M. leprae foram de 80% e especificidade de 90.90% para as amostras extraídas pelo método comercial e analisadas na plataforma portátil. No entanto, quando as amostras extraídas pelo protocolo simplificado contendo solução de ureia foram avaliadas, observou-se uma sensibilidade de 53.84% nas reações do Q3-Plus e 58.33% nas reações do QS-5. Esses resultados sugerem possíveis problemas de qualidade na etapa de purificação do material genético durante a extração de DNA. Os resultados preliminares destacam a necessidade de otimizar ainda mais o protocolo de extração simplificado, mas também demonstram a aplicabilidade da plataforma portátil na detecção de M.leprae e no auxílio ao diagnóstico da hanseníase, especialmente em locais de vulnerabilidade social, distantes dos centros urbanos. Abstract: Leprosy diagnosis primarily relies on clinical analysis due to the absence of a diagnostic test considered a "gold standard", primarily because of the wide variety of clinical forms the disease presents. However, both clinical analysis and existing complementary tests, such as direct methods like bacilloscopic and histopathology, and indirect methods like serology, suffer from a lack of sensitivity, especially in the paucibacillary (PB) form of the disease. Molecular techniques, particularly quantitative polymerase chain reaction (qPCR), have shown high sensitivity and specificity, addressing some of the limitations of leprosy diagnosis. Nevertheless, due to the requirements for expensive reagents, laboratory infrastructure, and controlled environments, molecular testing is often confined to larger centers. This scenario contributes to underdiagnosis and neglect of disease, particularly in socially vulnerable populations and remote regions. The primary objective of this study was optimize qPCR reactions using oligonucleotides from the first national kit for leprosy molecular diagnosis on a portable platform (Q3-Plus). Additionally, we aimed to evaluate minimally invasive sampling methods and develop a simplified DNA extraction protocol aligning with the point-of-care concept. In the optimization of Q3-Plus reactions, optical parameters, thresholds, and cutoff values were established for the 16S rRNA and RLEP targets of M. leprae using synthetic DNA, purified M. leprae DNA, and precharacterized clinical samples. The assessment of minimally invasive sampling techniques involved tape-stripping and micro-needling on regions near the ulnar nerve of healthy volunteers, with qPCR analysis targeting the 18S rRNA mammalian gene. Results indicated low DNA recovery, leading to the decision to evaluate only skin biopsy samples in the Q3-Plus, as they are considered the most sensitive for leprosy diagnosis. For the simplified DNA extraction from skin samples, different lysis solutions were tested, employing chaotropic agents such as urea, guanidine, and ammonium hydroxide. The purification step involved depositing the lysed material on FTA cards, with various elution methods assessed. The final evaluation of extraction protocols was conducted via qPCR amplification of the 18S rRNA mammalian target, using porcine skin as a comparative model. Among the evaluated solutions, guanidine-based protocols showed lower skin fragment dissolution, while the urea-based solution exhibited better skin fragment dissolution and lower Ct values, indicating higher DNA concentrations. After determining the best protocol, the complete methodology (simplified extraction & qPCR on the portable platform) was assessed on precharacterized clinical skin biopsy samples and compared with the standard equipment (QuantStudio-5). The optimized Q3-Plus reactions showed an efficiency of 131.06% for the 16S rRNA target and 104.65% for RLEP, using both sample and purified M. leprae DNA. Concerning analytical sensitivity, the Q3-Plus reactions achieved 113.23 genome equivalents/?L for the 16S rRNA gene and 19.72 genome equivalents/?L for RLEP. The test's sensitivity for M. leprae detection was 80%, with a specificity of 90.90% for samples extracted using the commercial method and analyzed on the portable platform. However, when samples extracted using the simplified protocol with a urea solution were evaluated, a sensitivity of 53.84% in the Q3-Plus reactions and 58.33% in QS-5 reactions was observed. These results suggest potential issues with the quality of the genetic material purification during DNA extraction. The preliminary results emphasize the need for further optimization of the simplified extraction protocol. Nevertheless, they also demonstrate the applicability of the portable platform in M. leprae detection and leprosy diagnosis support, especially in socially vulnerable areas far from urban centers.
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