Ação antimicrobiana da cloramina T sobre um biofilme periodontal ex vivo

Abstract

Resumo: A periodontite é uma doença inflamatória microbiana crônica, multifatorial associada a um biofilme disbiótico. É prevalente na população mundial e se caracteriza pela perda progressiva dos tecidos de suporte dental. O biofilme dental é complexo, pode conter centenas de espécies bacterianas e é considerado o fator etiológico primário da periodontite. Os modelos de biofilme in vitro têm a finalidade de mimetizar os biofilmes in vivo, e com isso possibilitar diversas avaliações como análise morfológica, interações microbianas, resposta celular e ação de produtos que possam interferir na formação dos biofilmes, como os antimicrobianos. Os enxaguatórios bucais são meios químicos de controle do biofilme. O presente estudo teve como objetivo avaliar a ação antimicrobiana da cloramina-T (CT) sobre biofilmes periodontais ex vivo. Amostras de biofilmes foram coletadas de sítios periodontais profundos de uma paciente portadora de periodontite para o preparo de um inóculo, que foi transferido para um placa de 96 poços contendo meio de cultura BHI + Hemina 1% + sangue de carneiro 5%. Sobre a placa de 96 poços foi posicionada uma tampa contendo elementos dentários, que foram preparados e fixados de forma que em cada poço se posicionasse um elemento dentário. Então a placa foi encubada em anaerobiose a 37ºC por sete dias. Em seguida, os elementos dentários contendo biofilmes foram expostos às soluções de CT 0,2%, clorexidina (CLX) 0,12% e H2O destilada autoclavada. Foram testados os tempos de exposição de um minuto e doze horas. Concomitante ao modelo proposto, um dispositivo de biofilme de Calgary (DBC) foi utilizado nas mesmas condições, para informações comparativas. Para avaliação do modelo de biofilme ex vivo foram realizadas contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), análise de atividade celular pelo teste TTC e espectrometria, e análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura. Já para avaliação da ação da CT sobre os biofilmes formados foram realizadas contagem de UFC e análise de atividade celular pelo teste Cloreto de Trifeniltetrazólio (TTC) 1% e espectrometria. A análise estatística dos resultados foi realizada pelo teste Anova e pós teste de Tukey. Como resultados, foi observado que os biofilmes formados sobre as superfícies dentárias foram semelhantes aos formados no DBC em quantidade de UFC e percentual de atividade celular (p>0,05), mas morfologicamente apresentavam estrutura mais densa e uniforme. A exposição da solução CT durante um minuto aos biofilmes formados tanto sobre superfície dentária como no DBC resultou em uma quantidade de UFC inferior ao controle negativo (p>0.05) e superior à CLX (p<0,05). Quando os biofilmes foram expostos durante doze horas à CT resultaram menor quantidade de UFC que H2O (p<0,05) e semelhante a CLX e CLX doze horas (p>0,05). Em relação atividade metabólica, a CT utilizada por um minuto não causou alterações nos biofilmes, mas quando foi realizada doze horas de exposição, causou uma redução na atividade metabólica semelhante a CLX e CLX doze horas (p>0,05). Desta forma, biofilmes ex vivo densos e uniformes, cultivados a partir de amostras de biofilmes coletadas de sítios periodontais profundos foram desenvolvidos na superfície de elementos dentários extraídos. Não foi observada ação antimicrobiana da solução de CT a 0,2% sobre os biofilmes ex vivo quando utilizada por um minuto. Quando a CT foi utilizada por doze horas teve ação antimicrobiana semelhante à ação da CLX

Abstract: Periodontitis is a chronic, multifactorial, microbial inflammatory disease associated with a dysbiotic biofilm. It is prevalent in the world population and is characterized by the progressive loss of tooth support tissues. Dental biofilm is complex, can contain hundreds of bacterial species and is considered the primary etiological factor in periodontitis. The purpose of in vitro biofilm models is to simulate biofilms in vivo, thus allowing for various evaluations such as morphological analysis, microbial interactions, cellular response and the action of products that may interfere with biofilm formation, such as antimicrobials. Mouthwashes are chemical methods of biofilm control. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial action of chloramine-T (CT) on periodontal biofilms ex vivo. Biofilm samples were collected from deep periodontal sites of a patient with periodontitis to prepare an inoculum, which was transferred to a 96-well plate containing BHI + Hemin 1% + sheep's blood 5% culture medium. A plate containing dental elements was placed on top of the 96- well plate and prepared and fixed so that one dental element was placed in each well. The plate was then incubated in anaerobiosis at 37ºC for seven days. Dental elements containing biofilms were then exposed to solutions of 0.2% TC, 0.12% chlorhexidine (CLX) and autoclaved distilled H2O. Exposure times of one minute and twelve hours were tested. In addition to the proposed model, a Calgary biofilm device (DBC) was used under the same conditions for comparative information. To evaluate the biofilm model ex vivo, colony-forming units (CFU) were counted, cell activity was analyzed using the TTC test and spectrometry, and morphological analysis was carried out using scanning electron microscopy. In order to evaluate the action of TC on the biofilms formed, CFU counts were taken and cell activity was analyzed using the 1% Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) test and spectrometry. The results were statistically analyzed using the ANOVA test and Tukey's post-test. The results showed that the biofilms formed on the tooth surfaces were similar to those formed on the DBC in terms of the number of CFU and percentage of cell activity (p>0.05), but morphologically they had a denser and more uniform structure. Exposure of the CT solution for one minute to the biofilms formed both on the tooth surface and in the DBC resulted in a lower number of CFU than the negative control (p>0.05) and higher than CLX (p<0.05). When the biofilms were exposed for twelve hours to CT, the number of CFU was lower than H2O (p<0.05) and similar to CLX and CLX twelve hours (p>0.05). In terms of metabolic activity, CT applied for one minute did not cause any changes in the biofilms, but when it was applied for twelve hours, it caused a reduction in metabolic activity similar to CLX and CLX twelve hours (p>0.05). Thus, dense and uniform ex vivo biofilms grown from biofilm samples collected from deep periodontal sites were developed on the surface of extracted dental elements. No antimicrobial action of the 0.2% TC solution was observed on the ex vivo biofilms when used for one minute. When CT was used for twelve hours, its antimicrobial action was similar to that of CLX