Caracterização dos mecanismos envolvidos na migração celular induzida pela QSOX1b

Abstract

Resumo: Quiescina/sulfidril oxidase 1 (QSOX1) é uma flavoproteína predominantemente secretada (isoforma b) que contribui na montagem da matriz extracelular e regulação de proteínas como laminina, fibronectina e colágeno. Também modula a proliferação, migração e adesão de células tumorais, células musculares lisas e fibroblastos, sugerindo que pode atuar como promotor ou supressor de tumores, marcador tumoral, marcador de insuficiência cardíaca e regulador da função vascular. Nosso grupo mostrou, previamente que QSOX1b induz a proliferação e migração de células musculares lisas de aorta, através de superóxido e peróxido de hidrogênio intracelulares, respectivamente. Porém os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos continuam desconhecidos. Neste trabalho, utilizando imunofluorescência indireta e western blot foi avaliada a internalização de QSOX1b recombinante. Através da técnica de scratch foi avaliada a migração celular induzida pela QSOX1b recombinante endocitada e foram utilizados inibidores da endocitose para caracterizar esse processo. As imagens adquiridas por microscopia confocal mostraram uma rápida internalização da QSOX1b recombinante selvagem e mutada e a co-localização com EEA1 e Rab5, mas não com Rab7, indicando a presença da QSOX1b nos endossomos iniciais, mas não nos endossomos tardios. Os ensaios de scratch evidenciaram que a incubação com 500 nM de QSOX1b recombinante endocitada durante 30 minutos foi suficiente para induzir a migração celular nas próximas 24 horas. A inibição da endocitose mediada por caveola com metil-B-ciclodextrina ou com silenciamento gênico da caveolina 1, diminuiu drasticamente o efeito pró-migratório da QSOX1b selvagem. Esse efeito também foi confirmado por imunofluorescência, observando-se que QSOX1b recombinante ficou restrita à superfície celular após a inibição química ou gênica da endocitose. Como detectamos que QSOX1b colocaliza com Nox1, e de acordo com dados previamente publicados, aqui propomos que QSOX1 pode ser endocitada e internalizada com Nox1 e ativar Nox1 nos endossomos levando à produção de espécies reativas de oxigênio que possam promover a migração celular. Nossos dados não só proporcionam informação nova sobre a localização endossomal de QSOX1b, mas também apresentam um novo mecanismo regulador da migração celular.

Abstract: Quiescin/sulfhydryl oxidase 1 (QSOX1) is a predominantly secreted flavoprotein (isoform b) that contributes to the assembly of the extracellular matrix and regulation of proteins such as laminin, fibronectin and collagen. It also modulates the proliferation, migration and adhesion of tumor cells, smooth muscle cells and fibroblasts, suggesting that it may act as a tumor promoter or suppressor, tumor marker, heart failure marker and vascular function regulator. Our group previously showed that QSOX1b induces the proliferation and migration of aortic smooth muscle cells through intracellular superoxide and hydrogen peroxide, respectively. However, the molecular mechanisms involved in these processes remain unknown. In this work, using indirect immunofluorescence and western blot, the internalization of recombinant QSOX1b was evaluated. Through the scratch assay, cell migration induced by endocytosed recombinant QSOX1b was evaluated and endocytosis inhibitors were used to characterize this process. Images acquired by confocal microscopy showed rapid internalization of wild-type and mutant recombinant QSOX1b and co-localization with EEA1 and Rab5, but not Rab7, indicating the presence of QSOX1b in early endosomes but not in late endosomes. Scratch assays showed that incubation with 500 nM endocytosed recombinant QSOX1b for 30 minutes was sufficient to induce cell migration in the next 24 hours. Inhibition of caveola-mediated endocytosis with methyl-B-cyclodextrin or caveolin 1 gene knockdown, dramatically decreased the promigration effect of wild-type QSOX1b. This effect was also confirmed by immunofluorescence, showing that recombinant QSOX1b was restricted to the cell surface after chemical or gene inhibition of endocytosis. As we detected that QSOX1b colocalizes with Nox1, and in accordance with previously published data, here we propose that QSOX1 can be endocytosed and internalized with Nox1 and activate Nox1 in endosomes leading to the production of reactive oxygen species that can promote cell migration. Our data not only provide new information about the endosomal localization of QSOX1b, but also present a new regulatory mechanism of cell migration.