Efeito do estresse pelo aumento de temperatura na respiração, níveis de espécies relativas de oxigênio (ERO) e expressão do gene AaSERK em células de Araucaria angustifolia com diferentes potenciais embriogênicos

Abstract

Resumo: Araucaria angustifolia (Bertol) Kuntze, também conhecida como Pinheiro do Paraná está atualmente classificada como espécie em extinção. O aquecimento global representa uma nova ameaça para a floresta de araucária remanescente, uma vez que esta espécie é adaptada a regiões de temperatura média entre 12 e 18 ºC. Sabe-se também que o desenvolvimento de embriões somáticos (ES), que podem ser utilizados em estratégias de reflorestamento desta espécie, sofre a influência dos níveis de espécies reativas de oxigênio e da expressão do gene SERK, entre outros fatores, que podem atuar como sinalizadores no desenvolvimento da araucária. Assim, este estudo teve como objetivo investigar o efeito do estresse pelo aumento de temperatura (30 ºC) sobre fatores que possam interferir no desenvolvimento de embriões somáticos de culturas embriogênicas de A. angustifolia, com diferentes potenciais de maturação. Para tanto, foram utilizadas linhagens celulares de A. angustifolia responsivas (SE1) e não responsivas (SE6) ao desenvolvimento de embriões somáticos, submetidas ao estresse por alta temperatura (30 ± 1°C), por 24, 48 e 72h. A avaliação da morfologia por microscopia eletrônica de transmissão mostrou que as células SE1 e SE6 foram diferentemente afetadas pelo estresse. Para a linhagem SE6, após o estresse de 48h, observou-se um menor número de mitocôndrias de tamanho reduzido. No maior tempo de estresse (72h), estas organelas estavam rompidas em ambas as linhagens. Os níveis basais de ERO foram maiores na linhagem SE1 quando as células foram cultivadas na condição controle (25 ± 1 ºC). O estresse por 24h aumentou os níveis de ERO na linhagem SE1, seguindo-se uma redução em 48 e 72h. Por sua vez, na linhagem SE6, os níveis de ERO aumentaram após 24 e 48h de estresse, retornando aos níveis de controle nas 72 h. A proteína ATP sintase (subunidade B) foi encontrada nas duas linhagens, porém, em maior quantidade na linhagem SE6. O consumo de oxigênio foi maior, para todos os substratos avaliados (Glutamato mais malato, NADH, succinato e TMPD/ascorbato), em mitocôndrias da linhagem SE6. Não houve diferença na expressão da enzima AOX entre as linhagens, mas sua atividade foi maior nas células SE6 cultivadas a 25 ± 1 ºC. Em condições de estresse, o consumo de oxigênio foi maior (24h) na linhagem SE1 e reduzido na linhagem SE6 para todos os tempos de exposição. O gene AaSERK1 foi identificado em ambas as culturas, com maior expressão na linhagem SE1. Em condições de estresse houve um aumento na expressão desse gene para a linhagem SE1, em 24 e 48h. A partir destes resultados é possível concluir que as linhagens SE1 e SE6 respondem de forma distinta quando submetidas ao estresse pelo aumento de temperatura, sugerindo que este fator pode interferir no desenvolvimento de embriões de Araucaria angustifolia. Os resultados evidenciam, ainda, que os mecanismos de resposta ao estresse das células SE1 (responsivas) são mais efetivos em modular os níveis de ERO, que, por sua vez, estão relacionados a capacidade de maturação destas células.

Abstract: Araucaria angustifolia (Bertol) Kuntze, also known as Parana pine, is currently classified as endangered. Global warming represents a new threat to the remaining Araucaria Forest since this species is adapted to regions with temperatures between 12 and 18 ºC. It is also known that the development of somatic embryos (SE), which can be used in reforestation strategies for this species, is influenced by oxygen-reactive species levels and SERK gene expression, among other factors. Thus, this study aimed to investigate the effect of stress caused by temperature increase (30 ºC) on certain factors that may interfere with the development of somatic embryos of A. angustifolia embryogenic cultures with different maturation potentials. For that, A. angustifolia cell lines responsive (SE1) and non-responsive (SE6) to the development of somatic embryos were subjected to high-temperature stress (30 ± 1 °C), for 24, 48 and 72h. Transmission electron microscopy analysis showed that SE1 and SE6 cells were differently affected by stress. After 48h stress, a smaller number of mitochondria was observed for SE6 lineage. In the longest time of stress (72h), these organelles were disrupted in both lines. ROS levels were already higher in the SE1 line when cells were cultured in the control condition (25 ± 1 ºC). Stress for 24h increased ROS levels in the SE1 line, followed by a reduction in 48 and 72h. In turn, in the SE6 line, ROS levels increased after 24 and 48 hours of stress, returning to control levels at 72 hours. ATP synthase (B subunit) was identified in both lines; however, in greater amount in the SE6 line. Respiration was higher for all evaluated substrates (Glutamate plus malate, NADH, succinate and TMPD/ascorbate) in mitochondria from SE6 line. There was no difference in the expression of the AOX enzyme between the lines, but its activity was higher in SE6 cells cultured at 25 ± 1 ºC. Under stress conditions, oxygen consumption was higher (24h) in the SE1 line and reduced in the SE6 line for all exposure times. The AaSERK1 gene was identified in both cultures, with greater expression in the SE1 line. An increase in the expression of AaSERK1 occurred after heat stress by 24 and 48 h for SE1 cells. Based on these results, it is possible to conclude that the SE1 and SE6 lines respond differently when subjected to stress due to increased temperature, suggesting that this factor may interfere with the development of A. angustifolia embryos. The results also show that the stress response mechanisms of SE1 (responsive) cells are more effective in modulating ROS levels, which, in turn, are related to the maturation capacity of these cells.