Avaliação de método alternativo ao Kjeldahl para dosagem de proteínas no Antígeno de Montenegro de 1ª geração

Abstract

Resumo : A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada pelo protozoário do gênero Leishmania transmitido através da picada das fêmeas de flebotomíneos. De acordo com as manifestações clínicas, as leishmanioses se dividem em tegumentar (LT), caracterizada por lesões que acometem pele e mucosas, e visceral (LV), que acomete as vísceras. Dentre os testes para o diagnóstico da LT, destaca-se a Intradermorreação de Montenegro (IDRM). Esse teste apresenta vantagens como alta sensibilidade e especificidade diagnósticas, facilidade na execução e baixo custo, e, devido a essas características, a IDRM apresenta elevada demanda em regiões endêmicas. O Antígeno de Montenegro é o medicamento utilizado para induzir a resposta de hipersensibilidade tardia do teste e o Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos (CPPI), no Paraná, é um dos fabricantes desse reagente. Um dos desafios para a produção do Antígeno de Montenegro é quantificar com maior exatidão e precisão as proteínas da solução antigênica, visto que a quantidade de proteínas injetadas determina a intensidade da resposta imunológica. O método clássico empregado para dosagem de proteínas é o método de Kjeldahl, que dosa o nitrogênio total em uma amostra. No entanto, esse método apresenta alta imprecisão analítica, não é específico, pois quantifica nitrogênio não proteico, emprega solventes corrosivos, grande volume de amostra e é demorado. Diante disso, o objetivo do trabalho foi testar outros métodos para a quantificação de proteínas na solução de Antígeno de Montenegro, que possam substituir o método de Kjeldahl. Para tanto, os métodos testados foram semi-micro determinação de Kjeldahl, fluorométrico e os colorimétricos Biureto e Bradford. Os métodos colorimétricos não apresentaram sensibilidade para detectar as proteínas na solução. Pelo método semi-micro de Kjeldahl foi quantificado aproximadamente 22 µg/mL de proteínas e, conforme já esperado, o método apresentou uma alta imprecisão analítica para repetibilidade, pois o desvio-padrão relativo (DPR), obtido da sextuplicata de amostras analisadas, foi aproximadamente 29%. Além disso, mesmo sendo uma semi-microdeterminação, o volume de amostra requerida foi 40 mL. O método fluorométrico, por outro lado, quantificou 27 µg/mL de proteínas e apresentou uma baixa imprecisão analítica para a repetibilidade de 2,6%. Outras vantagens inerentes ao método fluorométrico empregado foram o baixo volume de amostra requerido (20µL) e, a execução simples e rápida do protocolo. Portanto, o método fluorométrico pode ser empregado para quantificar as proteínas do Antígeno de Montenegro.

Abstract: Leishmaniasis is a neglected tropical disease caused by protozoa of the genus Leishmania transmitted through the bite of female sandflies. According to the clinical manifestations, leishmaniasis is divided into tegumentary (LT), characterized by lesions that affect the skin and mucous membranes, and visceral (LV), which affects the viscera (LV). Among the tests for the diagnosis of LT, the Montenegro Skin Test (MST) stands out. This test has advantages such as high diagnostic sensitivity and specificity, ease of execution and low cost, and, due to thesecharacteristics, MST is in high demand in endemic regions. The Montenegro Antigenis the drug used to induce the late hypersensitivity response of the test, and the Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos (CPPI), in Paraná, is one of the manufacturers of this reagent. One of the challenges for the production of the Montenegro Antigen is to quantify the proteins in the antigenic solution with greater accuracy and precision, since the amount of injected proteins determines the intensity of the immune response. The classic method used to measure proteins is the Kjeldahl method, which measures the total nitrogen in a sample. However, this method has high analytical imprecision, is not specific, as it quantifies non-protein nitrogen, uses corrosive solvents, large sample volume and is time-consuming. Therefore, the objective of this work was to test other methods for the quantification of proteins in the Montenegro Antigen solution, which can replace the Kjeldahl method. For this purpose, the methods tested were semi-micro determination of Kjeldahl, fluorometric and colorimetric Biuret and Bradford. Colorimetric methods were not sensitive to detect proteins in the solution. By the Kjeldahl semi-micro method, approximately 22 µg/mL of proteins were quantified and, as expected, the method presented a high analytical imprecision for repeatability, since the relativestandard deviation (RSD) obtained from the sextuplicate of analyzed samples was approximately 29 %. Furthermore, even though it was a semi-microdetermination, the sample volume required was 40 mL. The fluorometric method, on the other hand, quantified 27 µg/mL of proteins and presented an low analytical inaccuracy for repeatability of 2.6%. Other advantages inherent to the fluorometric method used were the low sample volume used (20µL) and the simple and quick execution of the protocol. Therefore, the fluorometric method can be employed to quantify the Montenegro Antigen proteins.