Análises moleculares comparativas de estirpes de Herbaspirillum por PFGE, RAPD, RFLP e sequenciamento do gene que codifica o 16S rRNA

Abstract

Resumo: Herbaspirillum são organismos diazotróficos endofíticos associados a importantes gramíneas. A análise por eletroforese em campo pulsado do DNA genômico da estirpe Z78 de H. seropedicae indicou a presença um único cromossoma com tamanho de aproximadamente 5700 Kb. Neste trabalho foram ainda conduzidas análise comparativa das estirpes Z78, M2, ZA69, ZA95, Z152 e Z67 de H. seropedicae e a estirpe M4 de H. rubrisubalbicans por eletroforese em campo pulsado (PFGE), polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição com endonucleases HindIII ou Dral (RFLP), polimorfismo de amplificação aleatória (RAPD), e sequenciamento parcial do o Gene que Codifica o rRNA 16S. Os resultados obtidos com PFGE mostraram que todas as estirpes de Herbaspirillum analisadas possuem genoma circular com tamanho variando de 5302 Kb para a estirpe ZA69 a 5783 Kb para as estirpes M2 e M4. Diferentes perfis de PFGE foram obtidos quando a enzima Swal foi utilizada para produzir macro fragmentos de restrição. Os resultados das análises dos quatro métodos utilizados permitiram a construção de dendrogramas de similaridade consistentes, agrupando as linhagens estudadas em três grupos distintos: grupo I inclui M2 e M4; grupo II, ZA69; e grupo III, ZA95, Z78, Z67, e Z152. O padrão de bandas resultante da amplificação aleatória (RAPD) do DNA genômico das várias estirpes apresentou um maior nível de variabilidade do que o obtido com os outros métodos: cada estirpe apresentou um único perfil eletroforético com cinco dos seis iniciadores utilizados. A estirpe M2 de H. seropedicae foi posicionada geneticamente muito próxima à estirpe M4 de H. rubrisubalbicans em todas as análises realizadas neste estudo. Os resultados obtidos por experimentos de hibridização sugeriram que as estirpes Z78, Z67, Z152 e ZA95 de H. Seropedicae, possuem 5 cópias do o Gene que Codifica o rRNA 16S e que as estirpes M2 e ZA69 de H. seropedicae e M4 de H. rubrisubalbicans possuem 4 cópias deste gene.

Abstract: Herbaspirillum are endophytic diazotrophs associated with important agricultural crops. H. seropedicae strain Z78 was analysed by pulsed field gel electrophoresis, suggesting that its genome consists of one circular DNA molecule of approximately 5700 Kb. In this work we also compared six strains of H. seropedicae (Z78, M2, ZA69, ZA95, Z152 and Z67), and one strain of H. rubrisubalbicans (M4) using pulsed field gel electrophoresis (PFGE), restriction fragment length polymorphism (RFLP) using Hinólll or Dral restriction endonucleases, random amplified polymorphic DNA (RAPD), and partial sequence of 16S rRNA. Ali Herbaspirillum strains had circular chromosomes and their sizes varied from 5302Kb for strain ZA69 to 5783Kb for strains M2 e M4. Different PFGE profiles were obtained when the rare restriction endonuclease Swal was used to produce macrorestriction fragments. The analyses by the three methods produced consistent dendrograms of similarity allocating the strains studied in three distinct groups: group I consists of M2 and M4; group II, ZA69; and group III, ZA95, Z78, Z67 and Z152. The RAPD fingerprinting showed the highest variability, and each strain had a unique electrophoretic pattern with 5 of 6 primers used. H. seropedicae M2 was found genetically very close to H. rubrisubalbicans M4 by ali analyses. Hybridization experiments showed that the H. seropedicae strains Z78, Z67, Z152 and ZA95 have 5 copies of the 16S rRNA gene and H. seropedicae strains M2 and ZA69, and H. rubrisubalbicans M4 have 4 copies of this gene.