Transposons de DNA : caracterização de sistemas de transposição TC1/Mariner e evolução de elementos Merlin em eucariotos

Abstract

Resumo: Os transposons de DNA podem ser vistos como veículos naturais de transferência devido a uma enzima chamada transposase, codificada pelo transposon, capaz de reconhecer repetições terminais invertidas (TIRs) presente nas suas extremidades. Quando expressa, a transposase se liga as TIRS e realizar sua excisão e reintegração em outra posição dentro do genoma. O Sistema Ingresso é uma plataforma desenvolvida para expressão heteróloga em células CHO (Chinese hamster ovary) que utiliza o transposon Sleeping beauty (SB) para integração genômica. Com o objetivo de entender o funcionamento do Sistema Ingresso como um todo, foram selecionadas 10 amostras (8 clones e 2 populações) de células CHO transfectadas com os vetores desse sistema contendo o gene de interesse Pró-trombina e selecionadas com o marcador GFP. Para a maioria das amostras, não foi observado uma correlação positiva entre a quantidade de cópias presente no genoma, o nível de mRNA e a quantidade de proteína expressa. Em relação ao local de inserção, foi possível verificar inserções em locais de atividade transcricional bem como regiões possivelmente silenciadas. O clone 28 que apresenta o maior nível de expressão da Pró-trombina mostrou o maior nível de mRNA e possui o maior número de cópias do transgene no genoma bem como maior número de locais de inserção exclusivos. Nessa amostra, foi confirmada a presença da SB no genoma, que pode levar a instabilidade genômica como a remobilização do cassete de expressão. Nossos dados indicam que o uso de uma transposase mais eficiente com capacidade de inserir um maior número de cópias do cassete por célula poderá levar a um ganho de expressão considerável da proteína de interesse. Como uma tentativa de aprimorar o sistema de transposição existente, uma nova Transposase também pertencente a superfamília Tc1-Mariner e suas respectivas TIRs foram adicionadas no lugar dessas regiões de SB. Apesar da atividade dessa nova Transposase não ter sido confirmada até o momento, uma população enriquecida com GFP, verificada por citometria de fluxo, sugere que houve atividade de mobilização do transgene da nova transposase. Nesse trabalho, também foi realizada uma análise da superfamília Merlin explorando a sua distribuição de maneira global nos eucariotos. Esses elementos foramidentificados em animais, fungos, plantas e protistas e, pela primeira vez, sua presença foi relatada em Rhodophyceae, Metamonada, Discoba e Alveolata. Os resultados desse trabalho mostram que Merlin é mais amplamente distribuído do que inicialmente descrito. Além disso, este é o primeiro relato de um transposon de DNA em protozoários flagelados da ordem Kinetoplastida, com a Transposase Merlin conservada identificada em Bodo saltans e Perkinsela sp. As árvores evolutivas sustentam que Merlin é provavelmente uma superfamília antiga, com eventos iniciais de diversificação e perdas secundárias. Várias famílias potencialmente ativas foram caracterizadas, algumas, curiosamente, com TIRs altamente imperfeitas, e famílias contendo repetições in tandem internas. Ainda, vários casos potenciais de domesticação de Merlin foram encontrados. Estudos como esse, de caracterização de novos transposons, são importantes não somente para o entendimento do papel dessas sequências na evolução e funcionamento dos genomas, mas também fornecem informações relevantes no contexto de uso biotecnológico dessas sequências.

Abstract: DNA transposons can be seen as natural transfer vehicles due to an enzyme called transposase, encoded by the transposon, capable of recognizing inverted terminal repeats (TIRs) present at their ends. When expressed, a transposase binds like TIRS and performs its excision and reintegration at another position within the genome. The Ingresso System is a platform developed for heterologous expression in CHO cells (Chinese hamster ovary) that uses the transposon Sleeping Beauty (SB) for genomic integration. In order to understand the functioning of the Ingresso System as a whole, 10 (8 clones and 2 units) of CHO cells transfected with the Ingresso System vectors containing the gene of interest Prothrombin were selected and selected with the GFP marker. For most sample, a positive correlation was not observed between the number of copies present in the genome, the level of mRNA and the amount of expression expressed. Regarding the insertion site, it was possible to verify the local insertions of transcriptional activity as well as possibly silenced regions. Clone 28 that has the highest level of Prothrombin expression exhibited the highest level of mRNA and has the highest number of copies of the transgene in the genome as well as the highest number of unique insertion sites. In this sample, the presence of SB in the genome was confirmed, which can lead to genomic instability such as the remobilization of the expression cassette. Our data indicate that the use of a more efficient transposase capable of inserting a greater number of copies of the cassette per cell can lead to a gain in the expression of the protein of interest. As an attempt to improve the existing transposition system, a new Transposase also belonging to the Tc1-Mariner superfamily and its latest TIRs were added in place of these SB regions. Although the activity of this novel transposase has not been confirmed so far, a population enriched with GFP, verified by flow cytometry, included the transgene mobilization activity of the novel transposase. In this work, an analysis of the superfamily Merlin was also carried out, exploring its global distribution in eukaryotes. These elements were identified in animals, fungi, plants and protists and, for the first time, their presence was reported in Rhodophyceae, Metamonada, Discoba and Alveolata. The results of this work show that Merlin is more widely distributed thaninitially described. Furthermore, this is the first report of a DNA transposon in flagellated protozoa of the order Kinetoplastida, with the conserved Merlin Transposase identified in Bodo saltans and Perkinsela sp. Evolutionary trees maintain that Merlin is likely an ancient superfamily, with early events of diversification and secondary losses. Several potentially active families have been characterized, some, interestingly, with highly imperfect TIRs, and families containing internal in tandem repeats. Also, several potential cases of Merlin domestication have been found. Studies like this one, for the characterization of new transposons, are important not only for understanding the role of these sequences in the evolution and functioning of genomes, but also provide relevant information in the context of biotechnological use of these sequences.