Desenvolvimento e caracterização de anticorpos monoclonais produzidos contra produtos finais de glicação avançada (AGEs) no contexto da doença renal crônica (DRC)

Abstract

Resumo: Os produtos finais de glicação avançada (AGEs) são um grupo heterogêneo de moléculas que se acumulam no plasma e tecidos em diversas condições clínicas, tais como envelhecimento, diabetes e falência renal. Evidências crescentes apontam tais moléculas como toxinas urêmicas as quais são efetoras no processo fisiopatológico de complicações vasculares e renais, em virtude de sua capacidade de modificar de forma irreversível as propriedades químicas e funcionais de uma série de moléculas, entre elas as proteínas. Existem atualmente mais de 20 tipos de AGEs descritos, metilglioxal, N-carboximetillisina (CML) e pentosidina os melhores caracterizados até o momento, e que servem como marcadores de acúmulo de AGEs em uma ampla gama de tecidos, sendo a CML o domínio antigênico mais abundante e melhor caracterizado. O presente estudo teve como objetivo produzir e caracterizar anticorpos monoclonais anti-CML para uso na confecção de ensaios que possam detectar e quantificar essa toxina em fluídos biológicos e aplicação desta ferramenta no entendimento das vias de sinalização envolvidas com a progressão da Doença Renal Crônica (DRC). Para tanto, três diferentes moléculas protéicas carreadoras foram modificadas por glicação: hemocianina de molusco (KLH), soro albumina bovina (BSA) e soro albumina humana (HSA); caracterizadas por eletroforese e espectrometria de massa. As moléculas glicadas foram usadas como imunógenos em camundongos Balb-c para produzir anticorpos policlonais e monoclonais epítopo-específico capazes de reconhecerem o domínio CML. Sete clones e quatorze subclones foram obtidos e testados frente ao CML e respectivos controles. Dentre os subclones, o anticorpo monoclonal mAb 2D6G2, foi selecionado com base nos ensaios de especificidade para melhor caracterização e empregado na detecção de CML. Para validação dos anticorpos produzidos foram utilizados soros de pacientes em diferentes estágios de DRC. Posteriormente, diferentes condições como variação nas concentrações de antígenos, anticorpos e diluições dos soros foram avaliadas a fim de padronizar um teste de ELISA competitivo capaz de detectar e quantificar CML em soro. Os resultados obtidos permitiram correlacionar concentração de CML nos soros com os diferentes estágios da doença. Além disso, o mAb 2D6G2, foi empregado em ensaios in vitro em células THP-1 com intuito de avaliar a interação de CML-HSA no ambiente celular. Nossos resultados demonstram a eficiência do anticorpo produzido, e abrem novas perspectivas para o emprego de tais anticorpos como bioferramenta na detecção, quantificação e entendimento dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na toxicidade urêmica relacionada a DRC. . Palavras chave: Doença renal crônica, toxinas urêmicas, AGEs, CML, anticorpo monoclonal.

Abstract: The advanced glycation end products (AGEs) are a heterogeneous group of molecules that accumulate in the plasma and tissues in several clinical conditions such as aging, diabetes and renal failure. These molecules have been show to act as uremic toxins and effectors in the pathophysiological vascular damage and renal complications, because of their ability to modify irreversibly chemical and functional properties of a number of molecules, among them proteins. Currently over 20 types of AGEs are described, including: methylglyoxal, N-carboxymethyllysine (CML) and, pentosidine, and they function as AGEs accumulation biomarkers widely used in several tissues, being CML the major antigenic domain. This work aimed the production and characterization anti-CML monoclonal antibodies for detection and quantification of this toxin in biological fluids. In addition this antibody may be used as a tool to investigate the signaling pathways involved in the CKD progression. Thus, three carrier proteins were modified by glycation: keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA) and human serum albumin (HSA); characterized by gel electrophoresis and mass spectrometry. The glycated molecules were used in Balb-c as immunogens to have the production of epitope-specific polyclonal and monoclonal antibodies able to recognize CML. Fourteen hybridomas were obtained and tested against CML and their respective controls. Among the hybridomas, mAb 2D6G2 was selected based on specificity assays and employed for further CML toxin characterization and detection. Analysis of serum sample from patients who presented different CKD stages were used for validation of home-made antibody. Furthermore, different conditions of antigens and antibodies concentrations, and serum dilutions were evaluated to standardize a ELISA competitive test capable to detect and measure serum CML.The results allowed to correlate CML concentration in serum samples with the different CKD stages. Beside, mAb 2D6G2 was employed in vitro in order to assess CML-HSA interaction with THP-1 cells. These results demonstrate the efficiency of the antibody mAb 2D6G2, and our data open new avenues for the use antibodies as tools in the detection, quantification and understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in uremic toxicity related to CKD. Key words: chronic kidney disease, uremic toxins, AGEs, CML, monoclonal antibody.