Metodologia para comparação de procedimentos de coleta e processamento para a integridade intestinal de frangos de corte visando a avaliação histomorfometrica

Abstract

Resumo: As características morfológicas do intestino delgado são de suma importância para a avicultura, e diversos estudos baseiam-se na histomorfometria como método auxiliar de avaliação. A histomorfometria, por sua vez, avalia as estruturas do intestino correlacionando a morfologia intestinal com a capacidade de absorção de novos alimentos. No entanto, muitas vezes este processo fica comprometido devido a autólise e alterações morfológicas destas estruturas em decorrência de falhas de coleta e processamento. Objetiva-se com este estudo, comparar diferentes métodos de coleta e processamento do jejuno de frangos de corte, visando encontrar a melhor técnica de processamento para a histomorfometria. Foram utilizados 55 frangos de corte (Gallus gallus domesticus), com 39 dias de vida, tratados com ração comercial e água ad libitum, os quais não foram submetidos a um desafio sanitário. As aves foram eutanasiadas e posteriormente coletou-se um fragmento de 7cm de jejuno O fixador utilizado foi formol a 10%, Esses segmentos de intestino foram submetidos a 11 técnicas com cinco animais cada, sendo eles: 1) aberto e fixado rapidamente; 2) fixado na forma de tubo e clivado na forma circular após 4 horas; 3) fixado na forma de tubo e clivado na forma circular após 6 horas; 4) aberto e lavado em formol antes da fixação; 5) aberto e limpo delicadamente com tesoura; 6) aberto e fixado em isopor em 4 extremidades; 7) aberto e fixado em isopor em 4 extremidades e lavado com formol 10% 4°C; 8) aberto e fixado em formol a 10% a 4° C; 9) fixado na forma de tudo com clivagem circular das extremidades; 10) fechado e lúmen lavado com formol e 11) amarrado às extremidades e inoculado com 4 ml de formol. Todas as amostras foram processadas para coloração de hematoxilina e eosina 48 horas após a coleta. Após processamento histológico, de cada amostra foi contabilizada o número de vilosidades aptas para aferição do comprimento de vilosidades e comprimento de cripta além da capacidade de avaliação da muscular intestinal e do comprimento total da mucosa. Na histologia foram descartadas as vilosidades autolisadas, dobradas, sobrepostas e partidas pelo processamento. A mediana das vilosidades obtida de cada técnica foi submetida a um Modelo Linear Generalizado com distribuição binomial negativa (MLG-NB). Os dados contínuos foram então submetidos ao teste de Tukey com valor de significância de p<0,05. As técnicas diferiram quanto a contagem média de vilosidade e cripta. Para ambos os casos, a técnica 1 teve médias estimadas comparáveis as técnicas 4 e 5, distinguindo-se dos demais. Todas as técnicas possibilitaram a realização da aferição da espessura da camada muscular e da espessura total da mucosa. Dessa forma conclui-se que a metodologia empregada na coleta influi na qualidade da amostra submetida a morfometria, e que técnicas de coleta que fixam o intestino aberto e com menor manipulação da amostra apresentam resultados mais satisfatórios para a avaliação morfométrica.

Abstract: The morphological characteristics of the small intestine are of paramount importance for poultry farming, and several studies are based on histomorphometry as an auxiliary evaluation method. Histomorphometry, in turn, evaluates gut structures by correlating intestinal morphology with the ability to absorb new foods. However, this process is often compromised due to autolysis and morphological changes in these structures as a result of collection and processing failures. The objective of this study is to compare different methods of collecting and processing the jejunum of broiler chickens, in order to find the best processing technique for histomorphometry. Fifty-five broilers (Gallus gallus domesticus) were used, 39 days old, treated with commercial feed and water ad libitum, which were not subjected to a sanitary challenge. The birds were euthanized and a 7cm fragment of jejunum was later collected. The fixative used was 10% formaldehyde. These intestine segments were submitted to 11 techniques with five animals each, as follows: 1) opened and quickly fixed; 2) fixed in tube form and cleaved in circular form after 4 hours; 3) fixed in tube form and cleaved in circular form after 6 hours; 4) opened and washed in formalin before fixation; 5) open and clean gently with scissors; 6) open and fixed in styrofoam at 4 ends; 7) opened and fixed in styrofoam at 4 ends and washed with 10% formalin at 4°C; 8) opened and fixed in 10% formalin at 4°C; 9) fixed in the form of a tube with circular cleavage of the ends; 10) closed and lumen washed with formalin and 11) tied to the ends and inoculated with 4 ml of formalin. All samples were processed for hematoxylin and eosin staining 48 hours after collection. After histological processing, the number of villi capable of measuring the length of the villi and crypt length was counted for each sample, in addition to the ability to evaluate the intestinal muscle and the total length of the mucosa. In histology, autolyzed, folded, overlapping and split villi were discarded by processing. The median of the villi obtained from each technique was submitted to a Generalized Linear Model with negative binomial distribution (MLG-NB). The continuous data were then submitted to the Tukey test with a significance value of p<0.05. The techniques differed in the mean villus and crypt counts. For both cases, technique 1 had estimated averages comparable to techniques 4 and 5, distinguishing itself from the others. All the techniques made it possible to measure the thickness of the muscular layer and the total thickness of the mucosa. Thus, it is concluded that the methodology used in the collection influences the quality of the sample submitted to morphometry, and that collection techniques that fix the open intestine and with less manipulation of the sample present more satisfactory results for the morphometric evaluation.