Identificação e caracterização in vitro da atividade antiviral de compostos químicos sintéticos contra o Mayaro vírus

Abstract

Resumo: Arbovírus são vírus transmitidos a hospedeiros vertebrados por artrópodes e fazem parte de várias famílias de vírus, como Flaviviridade, Togaviridade, Reoviridae, Rhabdoviridae e Peribunyaviridae. No Brasil, as arboviroses são consideradas um problema de saúde pública e a co-circulação do vírus Dengue (DENV), Zika (ZIKV), Febre Amarela (YFV) e Chikungunya (CHIKV) vem mobilizando autoridades sanitárias devido à alta morbidade e mortalidade associada a estas infecções. No entanto, existe outro arbovírus negligenciado, como o vírus Mayaro (MAYV), que também está presente neste contexto epidemiológico e causa síndromes graves. Os surtos de MAYV estão geralmente localizados nos estados do norte e centro-oeste do Brasil, no entanto, nos últimos anos vêm sendo detectados em outras regiões do país. As medidas de vigilância epidemiológica ainda são incipientes e não há abordagens profiláticas efetivas e nem tratamentos com drogas antivirais para este arbovírus negligenciado. Assim, o objetivo deste estudo é avaliar a atividade antiviral de compostos sintéticos contra infecções pelo MAYV usando para análise um sistema de microscopia de imunofluorescência de alto rendimento (do inglês Image High-Throughput Screening, iHTS). Foram avaliadas duas bibliotecas de compostos: 1) biblioteca comercial aprovada pela FDA (Torciscreen; n=52); e 2) biblioteca de compostos do Laboratório de Virologia Molecular com 52 compostos (naringenina e derivados n=21; crisina e derivados n=9; carbamatos n=22). Em uma primeira abordagem, a triagem de compostos com atividade antiviral foi padronizada e validada por iHTS. Em uma etapa posterior, os compostos que apresentaram a melhor atividade e menor toxicidade foram selecionados para testes adicionais, como: 1) ensaios de citotoxicidade in vitro e apoptose; 2) curvas de dose-resposta (cálculo de CC50, IC50 e IS); 3) estratégia de tempo de exposição; 4) confirmação da atividade antiviral em diferentes linhagens celulares e genótipos virais. O ensaio de iHTS apresentou os melhores resultados (Z score) quando realizado com os parâmetros de 2x104 células Huh7.5/poço, MOI de 0,5 por 24 horas, resultando na média de infecção de 33,7% +/- 6.3 com valor de confiabilidade estatística representada pelo Z score de 0,9044. Assim, iniciamos a triagem de 104 compostos divididos em flavonóides (flavona e flavonona), carbamatos e os aprovados pela FDA. Destes, 7 compostos (naringenina, LLA5A, LLA5B, LLA9A, crisina, éster C6 e PPC105) em diferentes concentrações apresentaram os critérios mínimos de seleção (80% de redução da infecção e 80% de viabilidade celular por quantificação nuclear). A curva dose-resposta foi determinada e 4 compostos candidatos foram selecionados para atividade anti-MAYV por apresentarem os maiores índices de seletividade (IS). A dose máxima não toxica (DMNT) de cada composto foi determinada segundo dados de dois ensaios: iHTS e citometria de fluxo. Com isso, para naringenina, LLA9A, crisina e éster C6 as concentrações de 200, 50, 25 e 25 µM, respectivamente, foram determinadas como DMNT. Em seguida, realizamos a investigação dos possíveis mecanismos de ação de cada um dos compostos, através do ensaio virucida, adsorção e internalização viral e tempo de adição. Os três primeiros ensaios indicaram que a atividade antiviral dos compostos ocorre durante as etapas iniciais do ciclo de infecção do MAYV nas células. Como resultados, os tratamentos pós infecção diminuíram significativamente a porcentagem de infecção e títulos de partícula virais infecciosas, indicando que a ação provável ocorra em etapas da replicação viral. Os dados foram confirmados usando outras linhagens celulares, bem como, cepas de MAYV de outro genótipo. Nossos estudos abrem uma nova perspectiva para a inibição da infecção pelo MAYV com a identificação de compostos com atividade e deverão ser estendidos para avaliação em modelos in vivo.

Abstract: Arboviruses are viruses transmitted to vertebrate hosts by arthropods and are part of several virus families, such as Flaviviridade, Togaviridade, Reoviridae, Rhabdoviridae e Peribunyaviridae. In Brazil, arboviruses are considered a public health problem, and the co-circulation of Dengue (DENV), Zika (ZIKV), Yellow Fever (YFV) and Chikungunya (CHIKV) viruses has been mobilizing health authorities due to high morbidity and mortality. associated with these infections. However, there is another neglected arbovirus, such as the Mayaro virus (MAYV), which is also present in this epidemiological context, and causes severe syndromes. MAYV outbreaks are generally located in the northern and central-western states of Brazil, however, in recent years they have been detected in other regions of the country. Epidemiological surveillance measures are still incipient and there are no effective prophylactic approaches or treatments with antiviral drugs for this neglected arbovirus. Thus, the aim of this study is to evaluate the antiviral activity of synthetic compounds against MAYV infections using an image High-Throughput Screening (iHTS) system for analysis. Two libraries of compounds will be evaluated: 1) FDA-approved commercial library (Torciscreen); and 2) library of compounds from the Laboratory of Molecular Virology with 52 compounds. In a first approach, the screening of compounds with antiviral activity was standardized and validated by iHTS. In a later step, the compounds that showed the best activity and the lowest toxicity were selected for additional tests, such as: 1) in vitro cytotoxicity and apoptosis assays; 2) dose-response curves (calculation of CC50, IC50 and IS); 3) exposure time strategy; 4) confirmation of antiviral activity in different cell lines and viral genotypes. The iHTS assay showed the best results (Z score) when performed with the parameters of 2x104 Huh7.5 cells/well, MOI of 0.5 for 24 hours, resulting in an average infection of 33.7%±6.3 with a statistical reliability value represented by the Z score of 0.9044. Thus, we started the screening of 104 compounds divided into flavonoids (flavone and flavonone), carbamates and those approved by the FDA. Of these, 7 compounds (naringenin, LLA5A, LLA5B, LLA9A, chrysin, C6 ester and PPC105) at different concentrations presented the minimum selection criteria (80% reduction in infection and 80% cell viability by nuclear quantification). The dose-response curve was determined and 4 candidate compounds were selected for anti-MAYV activity because they had the highest selectivity indices (SI). The maximum non-toxic dose (DMNT) of each compound was determined according to data from two assays: iHTS and flow cytometry. Thus, for naringenin, LLA9A, chrysin and C6 ester concentrations of 200, 50, 25 and 25 µM, respectively, were determined as DMNT. Then, we carried out the investigation of the possible mechanisms of action of each of the compounds, through the virucidal assay, viral adsorption and internalization, and addition time. The first three assays indicated that the antiviral activity of the compounds occurs during the initial stages of the MAYV infection cycle in cells. As a result, pre-treatments and post-infection treatments significantly decreased the percentage of infection and infectious viral particle titers, indicating that the action likely occurs at later stages of the viral cycle such as viral replication and/or assembly. Data were confirmed using other cell lines as well as MAYV strains from another genotype. Our studies open a new perspective for the inhibition of MAYV infection with the identification of compounds with activity and should be extended for evaluation in in vivo models.