Avaliação biofísica e funcional de fatores de crescimento da família EGF e fragmentos de anticorpos recombinantes

Abstract

Resumo: Fatores de crescimento da família EGF e NRG tem importantes papéis na sinalização celular para proliferação, diferenciação e sobrevivência. Todos os membros dessas famílias interagem com receptores ErbB através de seus domínios estruturais EGF. O fato de o domínio EGF dos diferentes fatores de crescimento EGF compartilharem a mesma conformação com três pontes dissulfeto na combinação C1-C3, C2-C4 e C5-C6 e se ligarem a mesma família de receptores apresenta algumas dificuldades tanto para a produção recombinante dos domínios EGF quanto para a sua detecção e identificação específica. Portanto, ferramentas bioquímicas robustas e específicas são necessárias para estudar os diferentes ligantes dessas famílias. Nesse sentido, existem os anticorpos e seus derivados que podem ser obtidos a partir de organismos vivos ou de bibliotecas sintéticas. Para isso, o objetivo deste trabalho foi desenvolver fragmentos de anticorpos do tipo scFv com sequências derivadas de anticorpos de origem animal sequenciados por espectrometria de massas e VHHs selecionados da literatura para o método de apresentação em bactéria. Os fragmentos derivados de anticorpos animais do tipo scFv foram expressos em diferentes construções, mas se mostraram instáveis e de pouco rendimento na avaliação por cromatografia por exclusão de tamanho, DLS supersensível e nanofluorimetria de varredura diferencial. Os anticorpos comerciais que deram origem aos scFvs foram avaliados pelas mesmas técnicas e demonstraram ter diferentes afinidades pelos domínios EGF em ensaios do tipo dot blot e qualidades estruturais distintas, tais como estabilidade e agregabilidade, como visto pelo DLS supersensível. O teste de apresentação em superfície bacteriana demonstrou que as construções de VHHs conseguem se ligar ao EGF e que quando o EGF é fusionado a mRFP há um impedimento da ligação. Ademais, a proteína de membrana inaQ apresentou níveis mais elevados de expressão de ambos VHHs propostos, sendo a mais adequada para o ensaio de apresentação em superfície bacteriana quando comparada à proteína Neae. Além disso, neste trabalho também foi desenvolvido um protocolo unificado para produção recombinante dos domínios EGF de sete fatores da família EGF e da NRG1? em Escherichia coli. Estes domínios foram caracterizados por diversas técnicas biofísicas para avaliar sua conformação. Sua atividade foi demonstrada em ensaios funcionais utilizando cultura de células. Este protocolo representa uma solução técnica simples e eficiente para obtenção dos fatores da família EGF, facilitado o desenvolvimento de pesquisas sobre a função de proteínas que contém o domínio EGF.

Abstract: Growth factors of EGF and NRG families have important roles in cell signaling for proliferation, differentiation, and survival. All members of these families interact with ErbB receptors through their EGF structural domains. The fact that the EGF domain of the different EGF growth factors share the same conformation with three disulfide bonds in the combination C1-C3, C2-C4 and C5-C6 and bind to the same type of receptors poses some difficulties both for recombinant production of the EGF domains and for their specific detection and identification. Therefore, robust, and specific biochemical tools are required to study the different ligands of these families. Antibodies and their fragments that can be obtained from living organisms or from synthetic libraries are used for this purpose. Considering this, the objective of this work was to develop scFv antibody fragments with sequences derived from mass spectrometry-sequenced animal antibodies and VHHs selected from the literature for bacterial surface display. scFv derived from animal antibodies were expressed using different constructs. However, expression resulted in either low yield or they turned out to be unstable according to evaluations performed by size exclusion chromatography, supersensitive DLS and differential scanning nanofluorimetry. Commercial antibodies that gave rise to the scFvs were evaluated by the same techniques and presented different affinities for EGF domains in dot blot assays and distinct structural qualities, such as stability and aggregability, as seen by supersensitive DLS. The bacterial surface display test revealed that the VHHs constructs can bind to EGF. However, when fused to mRFP, the EGF domain is no longer recognized by this VHH. The membrane protein inaQ showed higher expression levels for both proposed VHHs tested, presenting higher potential for bacterial surface display as compared to the protein NEAE. In this work, a unified protocol was developed for recombinant production of EGF domains of the EGF and NRG1? families in Escherichia coli. All recombinant EGF domains were characterized using a set of biophysical techniques to verify their conformation and their biochemical activities demonstrated in cell growth and proliferation assays. This protocol provides a simple and efficient technical solution for recombinant production of EGF family domains, facilitating the development of research involving the EGF domain function.