Dinâmica proteômica de Escherichia coli em resposta à limitação de nitrogênio

Abstract

Resumo: O nitrogênio é um elemento necessário para a biossíntese de diversas biomoléculas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos. Na ausência de nitrogênio, procariotos como Escherichia coli cessam imediatamente o crescimento. Amônio é a fonte de nitrogênio de preferência para E. coli e confere as maiores taxas de crescimento. Sob condições de limitação de amônio, E. coli é capaz de utilizar fontes alternativas de nitrogênio, sendo que esta reprogramação é conduzida através da indução do regulon NtrC. Neste trabalho foi utilizada a técnica de proteômica livre de marcação para determinar a dinâmica da expressão de proteínas de E. coli em resposta à privação de nitrogênio, tanto inicialmente (30 min) quanto tardiamente (60 min). A abundância de proteínas e modificações pós-traducionais confirmaram que a ativação do regulon NtrC atua como a primeira linha de defesa da célula contra a falta de nitrogênio. A poteína Rmf (ribosome modulation fator) foi induzida logo após a célula ser submetida à privação de amônio, seguido da expressão de outras proteínas que atuam inativando os ribossomos, como Hpf e RaiA, apoiando a hipótese de que a inativação dos ribossomos é um processo importante durante a limitação de nitrogênio. O promotor rmf foi estudado e contém um promotor sigma54 além do sítio de ligação sigma70. Os dados proteômicos revelaram que a parada do crescimento devido à falta de nitrogênio se correlaciona com o acúmulo de proteínas envolvidas na condensação do DNA, no catabolismo de RNA e proteína e com hibernação de ribossomo. Coletivamente, essas adaptações proteômicas resultam em células metabolicamente inativas que possivelmente exibem tolerância a múltiplas drogas.

Abstract: Nitrogen is needed for the biosynthesis of biomolecules including proteins and nucleic acids. In the absence of fixed nitrogen, prokaryotes such as E. coli immediately ceases growth. Ammonium is the preferred nitrogen source for E. coli supporting the fastest growth rates. Under conditions of ammonium limitation, E. coli can use alternative nitrogen sources and this reprogramming is orchestrated by the induction of the NtrC regulon. We use label free proteomics to determine the dynamics of E. coli proteins expression in response to nitrogen starvation after both short (30 min) and long (60 min) term. Protein abundances and post-translational modifications confirmed that activation of the NtrC regulon acts as the first line of defense against nitrogen starvation. The ribosome inactivating protein Rmf was induced shortly after ammonium exhaustion and this was followed by induction of other ribosome inactivating proteins such as Hpf and RaiA. These data support the hypothesis that ribosome shut-down is a key process during nitrogen limitation stress. The rmf promoter was studied and it contains a sigma54 promoter in addition to the sigma70 binding site. The proteomic data revealed that growth arrest due to nitrogen starvation correlates with the accumulation of proteins involved in DNA condensation, RNA and protein catabolism and ribosome hibernation. Collectively, these proteome adaptations will result in metabolic inactive cells which are likely to exhibit multidrug tolerance.