Embriotoxicidade induzida pelo ácido perfluorooctanóico e cádmio em Gallus gallus

Abstract

Resumo: O ácido perfluorooctanóico (PFOA) e o cádmio (Cd) são poluentes persistentes no ambiente, bioacumuláveis e capazes de transpor a barreira placentária. A exposição a esses contaminantes no período pré-natal interfere no desenvolvimento, comprometendo o crescimento e induzindo malformações no sistema nervoso, como defeitos do tubo neural (TN). No ambiente os organismos vivos estão expostos a uma mistura complexa de poluentes que podem interagir, potencializando ou inibindo seus efeitos tóxicos. Por isso, o estudo da neurotoxicidade no desenvolvimento induzida pelo PFOA e Cd é altamente relevante. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos desses contaminantes, isoladamente e em mistura, em dose única in ovo, sobre diferentes parâmetros, em embriões de Gallus gallus. Para isso, foram realizadas análises de mortalidade, ocorrência de malformações e caracterização histológica, análise de rede e enriquecimento funcional a partir de genes selecionados em base de dados toxicogenômicos comparativos, além de avaliação anatômica de animais eclodidos. Inicialmente, foram avaliadas diferentes resinas de incorporação para o estudo histológico dos embriões, sendo a historesina a que proporcionou maior precisão de orientação dos embriões para corte, aliada à excelente preservação das estruturas e poucos artefatos. Posteriormente, a exposição dos embriões foi realizada injetando-se solução de contaminante ou veículo na câmara de ar, previamente à incubação. As concentrações utilizadas foram 0,5 ng.ml-1, 5 ng.ml-1 e 50 ng.ml-1 de PFOA, 0,05 Mi.ml-1, 0,5 ng.ml-1 e 5 Mig.ml- 1 de Cd e a mistura de PFOA à 5 ng.ml-1 e Cd à 0,5 Mi g.ml-1. Os embriões foram incubados por 2 a 6 dias, 8, 21 dias, até a eclosão ou no máximo 24 dias. Foram avaliadas a mortalidade embrionária, a ocorrência de malformações e as alterações histológicas envolvidas nas malformações causadas nos estádios HH14 e HH18, com foco no tubo neural. O material coletado foi processado em historesina, com coloração de hematoxilina e eosina e ácido periódico de Schiff (PAS). Alterações significativas no aumento da mortalidade e malformações indicaram o efeito embriotóxico dos contaminantes no embrião de galinha. As alterações teciduais encontradas no TN corroboram as alterações observadas em montagem total de embriões expostos ao PFOA e Cd nas mesmas concentrações, sendo elas: desorganização das vesículas encefálicas, TN aberto, presença de aglomerados celulares e/ou células apoptóticas na luz do tubo neural, células apoptóticas no neuroepitélio e alteração na forma do TN. A marcação com PAS evidenciou a membrana basal principalmente da notocorda e TN, sendo que a intensidade média de marcação nas secções foi reduzida significativamente em relação ao controle, principalmente no HH18. Esses resultados revelam a ação desses contaminantes a nível histológico, já em estágios iniciais e foram compilados em um índice de lesão elaborado para embriões de galinha em estágios iniciais de desenvolvimento. Além disso, apontam os possíveis mecanismos celulares da ocorrência das malformações, que foram corroborados pela análise de enriquecimento funcional. Nos indivíduos eclodidos e não eclodidos, foram observadas alterações anatômicas compatíveis com as malformações encontradas nos embriões em estágios mais iniciais, evidenciando a permanência dessas alterações ao longo do desenvolvimento.

Abstract: Perfluorooctanoic acid (PFOA) and cadmium (Cd) are persistent and bioaccumulative environmental pollutants capable of crossing the placental barrier. Prenatal exposure to these contaminants interferes with development, impairing growth and inducing malformations in the nervous system, such as neural tube (NT) defects. Living organisms are exposed to complex mixtures of pollutants, which can interact, enhancing or inhibiting their toxic effects. Thus, the study of developmental neurotoxicity induced by PFOA and Cd, alone and in a mixture, is highly relevant. This work aimed to evaluate the effects of PFOA and Cd, isolated and in a mixture, in a single dose in ovo, on several parameters in the Gallus gallus embryo. To this end, mortality, malformations occurrence, histological characterization, network and functional enrichment of cured genes from Comparative Toxicogenomics Database (CTD), anatomical evaluation of hatched and non-hatched chicks were assessed. Initially, different embedding resins were evaluated for the histological study of the embryos, and historesin was the one that provided greater precision of orientation of the embryos for sectioning, allied to the excellent preservation of the structures and fewer artifacts. After, embryo exposure was performed by injecting contaminant solution or vehicle into the air chamber, before incubation. The concentrations used were 0.5 ng.ml-1, 5 ng.ml-1 and 50 ng.ml-1 of PFOA, 0.05 Mig.ml-1, 0.5 Mi.ml-1 and 5 ?g. ml-1 of Cd and the mixture of 5 ng.ml-1 PFOA and 0.5 Mi.ml-1 Cd. Embryos were incubated for 2 to 6 days, 8, 21, until hatching or a maximum of 24 days. Then, embryo mortality, the occurrence of malformations, and histological changes were characterized in stages HH14 and HH18, focusing on the neural tube. The collected material was processed in historesin and stained with hematoxylin and eosin (H&E) and periodic acid Schiff (PAS). Significant changes in mortality and occurrence of malformations indicated the teratogenic effect of contaminants on the chick embryo. Tissue changes found in NT corroborate alterations observed in the whole-mount analysis of embryos exposed to PFOA and Cd at the same concentrations, namely: brain vesicles disorganization, open NT, presence of cell clusters and/or apoptotic cells in the NT lumen, apoptotic cells in the neuroepithelium and alteration in the shape of the NT. PAS staining evidenced mainly the notochord and TN the basement membranes, and the average intensity of staining in the sections was significantly reduced when compared with the control, mainly at HH18. These results reveal the action of these contaminants at the histological level, even in early stages, and were compiled into a lesion index developed for chicken embryos at early stages of development. In addition, they point out the possible cellular mechanisms for the occurrence of malformations, which were corroborated by the analysis of functional enrichment. In hatched and non-hatched individuals, anatomical alterations compatible with the malformations found in early-stage embryos were observed, evidencing the permanence of these alterations throughout development.