Avaliação de fatores associados à gravidade de doença em pacientes do CHC-UFPR infectados com o vírus Influenza A

Abstract

Resumo: A gripe é uma doença respiratória infecciosa aguda causada pelo vírus influenza, dos quais o tipo A tem maior impacto na saúde pública mundial, está associada a altas taxas de morbimortalidade devido à propensão a evoluir para síndrome respiratória aguda grave (SRAG). Dado que a evolução para SRAG é multifatorial, o conhecimento de biomarcadores de gravidade pode ser uma ferramenta importante para o desenvolvimento de estratégias contra as infecções causadas pelo vírus influenza A (FluA). Portanto, este estudo teve como objetivos: padronizar a quantificação absoluta da carga viral (CV) por RT-qPCR e avaliar os fatores associados à gravidade de doença em pacientes infectados por FluA. A quantificação absoluta de CV foi padronizada com DNA plasmidial, apresentou eficiência de 98,6%, R2 de 0,998, faixa dinâmica de 10^1 a 10^10, limite de detecção e de quantificação de 6,77 e 20,52 cópias/reação, respectivamente. Não foi observada variabilidade inter e intra ensaio e nenhum efeito de matriz. Em todos parâmetros avaliados, os coeficientes de variação foram menores que 5%. Para a validação clínica do ensaio foram realizadas duas quantificações seriadas de CV de 19 pacientes com o diagnóstico laboratorial positivo para FluA, internados no período entre 2015 a 2018 no Complexo Hospital de Clínicas da UFPR (CHC-UFPR). As medições em série das amostras clínicas coletadas em um intervalo de 72 horas não mostraram nenhuma alteração na CV. Em contraste, os pacientes imunocompetentes apresentaram uma CV significativamente mais baixa do que os imunossuprimidos. Para a determinação dos multifatores relacionados com a gravidade da doença, foram incluídos no estudo um total de 142 pacientes, com diagnóstico laboratorial positivo para FluA, no período de 2010 a 2018, no CHC-UFPR. Os vírus FluA foram subtipados e tiveram sua CV quantificada pelo método de RT-qPCR padronizado no estudo. As mutações no gene da hemaglutinina foram avaliadas pelo sequenciamento nucleotídico e os genótipos dos polimorfismos de nucleotídeo único na interleucina 28B foram identificados por qPCR. A análise multivariada identificou os seguintes fatores de risco para a gravidade da doença: infecção pelo subtipo (H1N1)pdm09 (OR = 2,29; IC 95% = 1,02-5,15; p = 0,046), CV (OR = 1,43; IC 95% = 1,09-1,88; p = 0,009), doenças cardíacas (OR = 5,47; IC 95% = 1,96-15,27; p = 0,001) e doenças neuromusculares (OR = 7,02; IC 95% = 1,18-41,75; p = 0,032). Um índice de prognóstico preditivo para admissão na UTI com o potencial de otimizar a triagem e o manejo clínico de pacientes de alto risco foi proposto com base na curva ROC (Indice = 3, com AUC = 0,812; p <0,0001). A metodologia de CV padronizada pode ser aplicada para avaliar a evolução do quadro clínico dos pacientes por meio da quantificação seriada e da aplicação do escore proposto, uma vez que este apresentou alto desempenho em prever a admissão à UTI em pacientes infectados por FluA. No entanto, sua implementação no serviço de saúde está sujeito à validação em uma população maior.

Abstract: Influenza is an acute infectious respiratory disease caused by the influenza virus, of which type A has the greatest impact on public health worldwide and is associated with high rates of morbidity and mortality due to the propensity to progress to severe acute respiratory infection (SARI). Given that the evolution to SARI is multifactorial, knowledge of severity biomarkers can be an important tool for developing strategies against infections caused by the influenza A virus (FluA). Therefore, this study aimed to: standardize the absolute quantification of viral load (VL) by RT-qPCR and assess factors associated with disease severity in patients infected with FluA. The VL absolute quantification was standardized with plasmid DNA, showed an efficiency of 98.6%, R2 of 0.998, the dynamic range of 10^1 to 10^10, detection and quantification limits of 6.77, and 20.52 copies/ reaction respectively. No inter-and intra-assay variability and no matrix effect were observed. In all parameters evaluated, the coefficients of variation were less than 5%. For the clinical validation of the trial, two serial VC measurements were performed in 19 patients with a positive laboratory diagnosis for FluA and hospitalized in the period between 2015 and 2018 at the Complexo Hospital de Clínicas of UFPR (CHC-UFPR). Serial measurements of clinical samples collected over a 72-hour interval showed no change in CV. In contrast, immunocompetent patients had a significantly lower CV than immunosuppressed ones. To determine the multifactors related to the severity of the disease, a total of 142 patients with positive laboratory diagnoses for FluA were included in the study, in the period from 2010 to 2018, at the CHC-UFPR. FluA viruses were subtyped and had their VL quantified by the RT-qPCR method standardized in the study. Mutations in the hemagglutinin gene were evaluated by nucleotide sequencing, and the genotypes of single nucleotide polymorphisms in interleukin 28B were identified by qPCR. Multivariate analysis identified the following risk factors for disease severity: infection by subtype (H1N1)pdm09 (OR= 2.29; 95% CI= 1.02-5.15; p= 0.046), VL (OR= 1.43; 95% CI= 1.09- 1.88; p= 0.009), cardiovascular diseases (OR= 5.47; 95% CI= 1.96-15.27; p = 0.001) and neuromuscular diseases (OR= 7.02; 95% CI= 1.18-41.75; p= 0.032). A predictive prognostic index for ICU admission with the potential to optimize screening and clinical management of high-risk patients was proposed based on the ROC curve (Index = 3, AUC= 0.812; p<0.0001). The standardized VL methodology can be applied to assess the evolution of the clinical condition of patients through serial quantification and application of the proposed score since this presented a high performance in predicting admission to the ICU in patients infected with FluA. However, its implementation in the health service is subject to validation in a larger population.