Explorando os óleos essenciais de pimenta preta (Piper nigrum) e gengibre (Zingiber officinale) e seus princípios ativos no controle de biofilme multiespécie de Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium e Pseudomonas aeruginosa = Screening the essential oils of black pepper (Piper nigrum) and ginger (Zingiber officinale) and their active principles in the control of multispecies biofilme of Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium and Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Resumo: O estudo teve como objetivo avaliar a susceptibilidade do biofilme multiespécies composto por Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium ePseudomonas aeruginosa frente à ação dos óleos essenciais (OE) de pimenta preta(P) (Piper nigrum) e gengibre (GB) (Zingiber officinale), e princípios ativos depiperina e 6-gingerol na dinâmica de formação e expressão gênica em superfície de polipropileno. Para isso foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas(CIM) dos OE e princípios ativos. A formação de biofilme foi avaliada sob a interferência dos OE de pimenta preta e gengibre na concentração de 50 mg/mL e100mg/mL. Da mesma forma foram avaliados os princípios ativos de piperina e 6-gingerol. Para o OEP também foi avaliada a eficácia sobre o biofilme pré-formado. A associação dos três microrganismos resultou na MIC de 100 mg/ml para o OEP eOEGB, 25 mg/ml para piperina e 1,25 mg/mL para 6-gingerol. O biofilme multiespécies controle foi capaz de aderir à superfície de polipropileno obtendo um maior incremento populacional em 48 e 72 h (6,66 e 7,35 UFC/cm2,respectivamente). A concentração de 100 mg/mL de OEP demonstrou melhor ação,na adesão inicial em 1h, contudo, não houve diferença estatística entre as concentrações de OEP nos demais tempos de avaliação, havendo uma inversão no tempo de 12 h e posteriormente mantendo o mesmo comportamento. Para o OEGB foi verificado que na concentração de 100 mg/mL obteve-se uma diminuição de 99,8% nas células sésseis com relação ao controle. A adição de piperina na concentração de 25 mg/mL obteve as menores contagens de células sésseis quando comparado ao OEP, quanto a aplicação de 1,25 mg/ml de 6-gingerol não foi suficiente para evitar a formação do biofilme em superfície de polipropilenos(p>0,05). No biofilme multi espécies, L. monocytogenes regulou de forma positiva o gene agrC nos tempos de 24 h e 72 h, e passou a regular de forma positiva os genes agrD e prfA com 72h. S. Typhimurium e P. aeruginosa mantiveram a regulação gênica negativa para todos os genes avaliados nos tempos de avaliação. A aplicação de 25 mg/mL de piperina alterou a regulação de genes não apresentados no biofilme controle. L. monocytogenes em cultura associada passou a regular de forma positiva os genes agrB (24 h e 72 h), agrC (72 h), agrD (24 h e 72h) e prfA (24 h), ao observar a expressão de genes em culturas simples sobre a condição tratada, manteve o comportamento semelhante com o biofilme multiespécies controle, diferindo através do gene agrD que é regulado de forma positiva a partir de 24h de incubação e o gene agrC com regulação negativa. S.Typhimurium em cultura mista passou a regular de forma positiva os genes agfA (24h e 72 h), adrA (24 h e 72 h), e csgD (72 h), de forma individual manteve o mesmo comportamento que em associação, no entanto passa a regular de forma positiva o gene csgD no tempo de 24 h. P. aeruginosa em cultura mista regulou de forma positiva todos os genes avaliados com 24 h e 72 h de incubação e manteve o mesmo nível de regulação gênica (negativa) independente do tempo avaliado em cultura simples. OEP, OEGB e piperina demonstraram atividade antimicrobiana e antibiofilme, interferindo no processo de adesão a superfície e na manutenção de biofilmes maduros.

Abstract: The study aimed to evaluate the susceptibility of the multispecies biofilm composed by Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, and Pseudomonas aeruginosa against the action of essential oils (EO) of black pepper (Piper nigrum) and ginger (Zingiber officinale), and active principles of piperine and 6-gingerol on the formation dynamics and gene expression on polypropylene surface. For this, the minimum inhibitory concentrations (MIC) of the EOs and principles were determined. Biofilm formation was evaluated under the interference of black pepper and ginger EOs at concentrations of 50 mg/mL and 100 mg/mL. Similarly, the active ingredients of piperine and 6-gingerol were evaluated. The efficacy of the preformed biofilm was also evaluated for the OE black pepper. The association of the three microorganisms resulted in a MIC of 100 mg/mL for the OEP and ginger OE, 25 mg/mL for piperine, and 1.25 mg/mL for 6-gingerol. The control multispecies biofilm was able to adhere to the polypropylene surface obtaining a higher population increment in 48 and 72 h (6.66 and 7.35 CFU/cm2, respectively). The concentration of 100 mg/mL of OEP showed better action in the initial adhesion in 1h, however, there was no statistical difference between the concentrations of OEP in the other evaluation times, with an inversion in the time of 12 h and later maintaining the same behavior. For the ginger EO, it was verified that at the concentration of 100 mg/mL there was a 99.8% reduction in sessile cells compared to the control. The addition of piperine at a concentration of 25 mg/mL obtained the lowest sessile cell counts when compared to OEP, and the application of 1.25 mg/mL of 6-gingerol was not enough to prevent biofilm formation on the polypropylene surface (p>0.05). Multispecies biofilm L. monocytogenes positively regulated agrC gene at 24 and 72 h, and positively regulated agrD and prfA genes at 72 h. S. Typhimurium and P. aeruginosa maintained negative gene regulation for all genes evaluated in the evaluation times. The application of 25 mg/mL of piperine altered the regulation of genes not present in the control biofilm, L. monocytogenes in associated culture started to regulate in a positive way the genes agrB (24 h and 72 h), agrC (72 h), agrD (24 h and 72 h) and prfA (24 h), when observing the expression of genes in simple cultures on the treated condition, kept the similar behavior with the control multispecies biofilm, differing through the gene agrD that is regulated positively from 24h of incubation and the gene agrC with negative regulation. S. Typhimurium in mixed culture started to positively regulate genes agfA (24 h and 72 h), adrA (24 h and 72 h), and csgD (72 h). P. aeruginosa in mixed culture positively regulated all the genes evaluated at 24 and 72 h of incubation and maintained the same level of gene regulation (negative) independent of the time evaluated in simple culture. OEP, OEGB, and piperine showed antimicrobial and antibiofilm activity, interfering in the process of adhesion to the surface and the maintenance of mature biofilms.