Avaliação do efeito da deficiência da enzima a-galactosidase (a-GAL) e de sua reposição na disfunção endotelial na Doença de Fabry

Abstract

Resumo: A Doença de Fabry (DF) é uma doença de caráter hereditário, causada pela deficiência da enzima a-galactosidase (a-GAL), que leva ao acúmulo progressivo de globotriacilceramida (Gb3) nos lisossomos. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro e in vivo o efeito da terapia de reposição enzimática (TRE) na disfunção endotelial na DF. Para isso, foram analisados 52 pacientes com DF em TRE (agalsidase-B 1,0 mg/kg/e.o.w) através da avaliação dos níveis séricos dos biomarcadores de estresse oxidativo 3-Nitrotirosina (3-NT), de inflamação pelo fator de diferenciação de crescimento-15 (GDF-15), e de syndecan-1 sendo todos dosados por ELISA. Para investigar um possível efeito benéfico do início precoce da TRE, os pacientes foram divididos conforme a idade que iniciaram a TRE: (I) antes dos 40 anos (<=40) e (II) com 40 anos ou mais (>=40). Ensaios de mimetização da DF In vitro foram realizados por meio do bloqueio de a-GAL com cloroquina (0,5 gg/mL) em células endoteliais humanas e confirmados pelos ensaios de vermelho neutro (VN) e fluorescência com a sonda Lysotracker. As células endoteliais também foram tratadas com agalsidase-B para reverter o efeito da cloroquina. Por fim, avaliou-se a viabilidade celular por [4,5-dimethyl-thiazol-2-yl] -2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) e a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de óxido nítrico (NO). As principais manifestações clínicas encontradas no coorte de pacientes com DF foram nefropatia (67,3%) e cardiomiopatia (21,1%). Os níveis de 3-NT, syndecan-1 e GDF-15 foram de 33,3 (4,8-111,1) nm/mL, 55,7 (38,874,9) ng/mL e 541,8 (392,2-784,4) pg/mL, respectivamente. Houve associação entre GDF-15, 3-NT, syndecan-1 e TFG com a espessura septal interventricular (ESI) (p<0,05). Além disso, houve associação entre syndecan-1 com proteinúria de 24 h (p<0,04). GDF-15 e 3-NT apresentaram associação com o tempo em TRE (p<0,05). Os níveis séricos de GdF-1 5 foram mais altos em pacientes que iniciaram a TRE com >=40 anos em comparação com os <=40 anos dos pacientes correspondentes (p<0,0001). Além disso, a ESI foi significativamente maior (p<0,0001) em pacientes com idade >=40 anos. Nas células endoteliais, a cloroquina induziu ao acúmulo de organelas ácidas (p<0,05), aumentou os níveis de r O s e diminuiu a produção de NO (p<0,05), enquanto a agalsidase-B foi capaz de contrabalancear esses efeitos (p<0,05). A TRE manteve os pacientes estáveis e o estresse oxidativo foi controlado enquanto os níveis de biomarcadores foram levemente elevados. Em células endoteliais, a cloroquina induziu ao acúmulo de organelas ácidas e estresse oxidativo, o que foi atenuado com o tratamento com agalsidase -B.

Abstract: Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by mutations in the GAL gene that lead to systemic disorders. The aim of the present study was to investigate in vivo and in vitro the effect of enzyme replacement therapy (ERT) on endothelial dysfunction. The study included 52 classical FD patients on regular follow-up and receiving ERT (agalsidase-B 1.0 mg/kg/e.o.w.). The levels of 3-nitrotyrosine (3-NT), growth differentiation factor-15 (GDF-15), and syndecan-1 were measured by ELISA. To investigate the possible beneficial effects of early ERT treatment, patients who underwent ERT were divided into 2 groups according to age, and these groups included who began ERT (I) before age 40 (<=40) and those who began ERT at (II) age 40 or greater (>=40). To mimic FD in vitro, a-GAL blockage using chloroquine (0.5 pg/mL) was performed in human endothelial cells, and this was confirmed according to neutral red (NR) assay and fluorescence intensity using the Lysotracker probe. Subsequently, endothelial cells were treated with agalsidase-B. Finally, the cell viability was evaluated using 3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) - MTT assays and by assessing the production of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). The primary patient clinical manifestations were nephropathy (67.3%) and cardiomyopathy (21.1%). The levels of 3-NT, syndecan-1, and GDF-15 were 33.3 (4.8-111.1) nm/mL, 55.7 (38.8-74.9) ng/mL, and 541.8 (392.2-784.4) pg/mL, respectively. There was a positive correlation among GDF-15, 3-NT, and syndecan-1 and a negative correlation between eGFR and interventricular septal thickness (IVST) (p<0.05). Additionally, there was a correlation between syndecan-1 and 24 h proteinuria (P<0.04). GdF-15 and 3-NT exhibited a correlation with duration of E rT (p<0.05). Serum GDF-15 levels were higher in patients who began ERT at >=40 years compared to levels in those who began ERT at <=40 years (p<0.0001). Additionally, IVST was significantly high (p<0.0001) in patients aged >=40 years. In endothelial cells, chloroquine significantly induced the accumulation of acid organelles (p<0.05), increased ROS levels, and decreased NO production (p<0.05), and agalsidase-B could counterbalance these effects (p<0.05). ERT can maintain FD patients in a clinically stable state. In contrast, inflammatory biomarker levels in these patients were slightly elevated. In vitro, chloroquine induced the accumulation of acidic organelles (e.g., lysosomes) and oxidative stress in endothelial cells, and this was attenuated by agalsidase-B treatment.