Efficiency of spontaneous lactic acid fermentation to improve the qulity of raw milk containing high levels of Pseudomonas contamination : an alert for sanitary measures

Abstract

Resumo: Produtos lácteos fermentados têm sido um componente vital na dieta de grupos étnicos de todo o mundo desde tempos remotos. Nos dias atuais, a popularidade destes produtos tem aumentado devido às suas propriedades funcionais e ao aumento do tempo de vida de prateleira. Estes processos são realizados em sistemas abertos e baseiam-se na microbiota indígena presente na matéria-prima ou do inóculo originado pelo processo chamado backslooping. No primeiro capítulo deste trabalho, foi construída uma revisão crítica sobre o surgimento de tecnologias de sequenciamento de nova geração (SNG) e os impactos na caracterização microbiológica de produtos lácteos fermentados tradicionais. Os produtos abrangidos nesta revisão incluíram kefir, leitelho, koumiss, dahi, kurut, airag, tarag, khoormog, lait caillé e suero costeño. Grupos dominantes detectados por SNG, principalmente bactérias do ácido lático, também foram identificados por técnicas anteriores de caracterização microbiológica. No entanto, as plataformas de SNG revelaram a diversidade bacteriana total, incluindo microrganismos não cultiváveis, populações sub-dominantes e espécies de crescimento tardio. Os conhecimentos adquiridos são vitais para melhorar a monitorização, manipulação e segurança destes alimentos fermentados. Na segunda fase deste trabalho, foi avaliado o desempenho da fermentação espontânea de iogurte do tipo Mar Cáspio para melhorar a qualidade de leite pasteurizado contendo altos níveis de contaminação por Pseudomonas, com foco na segurança microbiológica e estabilidade do produto final. A diversidade bacteriana do leite pasteurizado, processo de fermentação e após 60 dias de armazenamento foi analisada por SNG e a presença de células viáveis foi confirmada através de cultivos em meios seletivos. Além disso, os metabólitos produzidos durante o processo fermentativo foram analisados por cromatografia líquida de alta performance e cromatografia gasosa com espectrometria de massa. Inicialmente, leites pasteurizados contendo altas contagens de Pseudomonas foram selecionados para a fermentação. Durante o processo fermentativo, sequências relacionadas com Pseudomonas, e em menor grau para Enterobacteriaceae, permaneceram constantes até o fim do processo. A abordagem dependente de cultivo confirmou a presença de Pseudomonas viáveis durante a fermentação. Acido lático foi o principal metabólito produzido (5.93 g/L em 24 horas de fermentação) e, entre os compostos voláteis encontrados, ácido benzóico e ácido hexanóico apresentaram aumentos significativos durante a fermentação. 2-nonanona foi também observado em concentrações significativas, o qual é considerado um biomarcador volátil de P. aeruginosa e espécies correlacionadas. Os resultados demonstraram que fermentações naturais podem frequentemente não inibir o desenvolvimento de agentes patogênicos e deteriorantes de origem alimentar. Finalmente, a terceira etapa deste estudo avaliou diferentes cepas de bactérias ácido-láticas (obtidas a partir do leite fermentado no estilo do mar Cáspio, mantido a 4ºC durante 60 dias) contra Pseudomonas aeruginosa. Isolados dos gêneros Leuconostoc e Lactobacillus apresentaram halos de inibição significativos, indicando que o produto é uma fonte promissora para isolamento de bactérias do ácido lático com atividade antimicrobiana.

Abstract: Traditional fermented milk products have been a vital component in the daily diet of ethnic groups all around the world since ancient times. Today, the popularity and availability of these products have been increased due to their functional properties and prolonged shelf-life. The fermentation process is performed in open systems and it is based on the indigenous microbiota present in the raw material or on the inoculum, originated from backslooping process. In the first chapter of this work, a critical review on the application of NGS for microbiome analysis of traditional fermented milk products worldwide was constructed. Fermented milk products covered in this review include kefir, buttermilk, koumiss, dahi, kurut, airag, tarag, khoormog, lait caillé, and suero costeño. In general, dominant species detected by culturing were also identified by NGS. However, NGS studies have revealed a more complex bacterial diversity, comprising uncultivable microorganisms, sub-dominant populations, and late-growing species. The knowledge that has been gained is vital in improving the monitoring, manipulation, and safety of these traditional fermented foods. In the second stage of this work, the performance of Caspian Sea-style spontaneous milk fermentation to improve the quality of pasteurized milk containing high levels of Pseudomonas contamination was evaluated, with a focus on microbiological safety and stability of the final product. Bacterial diversity of pasteurized milk, fermentation process, and after 60 days of storage was analyzed by NGS and the presence of viable taxa was confirmed by culturing on selective media. Microbial-derived metabolites were also analyzed by high-performance liquid chromatography and gas chromatography-mass spectrometry. Initially, pasteurized milks containing high Pseudomonas counts were selected for fermentation. Sequences related to Pseudomonas, and to a lesser extent to Enterobacteriaceae, remained constant throughout the fermentation process and the culture-dependent approach confirmed the presence of viable Pseudomonas through fermentation. Lactic acid (5.93 g/L in 24 h) was the major end-metabolite produced. Among the volatile compounds found, benzoic and hexanoic acids showed significant increase during fermentation in addition to 2-nonanone, a volatile biomarker of P. aeruginosa and related species. The results demonstrated that natural milk fermentation may often not inhibit the development of foodborne pathogens and food spoilage microorganisms. Finally, the third stage of this work evaluated lactic acid bacteria strains (isolated from Caspian Sea-style sample kept at 4ºC for 60 days) against Pseudomonas aeruginosa. Leuconostoc and Lactobacillus isolates showed a significant inhibition halo, suggesting that the product is a promising source for isolation of lactic acid bacteria with antimicrobial activity.