Loxoscelismo : avanços e desafios no desenho de fragmentos de anticorpos com potencial terapêutico

Abstract

Resumo: Envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles spp. (loxoscelismo) é um problema de saúde pública no Brasil, com mais de 6.000 casos por ano. O acidente é caracterizado por lesões dermonecróticas e/ou sistêmicas que, se não tratado de forma correta pode levar a sérios prejuízos inclusive a morte. O tratamento específico é baseado na administração do soro antiloxoscélico ou antiaracnídico. A produção do soro foi descrita há mais de um século e, apesar de eficaz trata-se de um método laborioso, que apresenta limitações importantes como a necessidade de altas quantidades de venenos brutos como imunógenos para os cavalos, o emprego de um grande número de animais, e seu uso pode implicar em reações adversas, dada a natureza heteróloga das imunoglobulinas. Atualmente, tem-se estudado o emprego de fragmentos de anticorpos recombinantes na terapia em diversas áreas da saúde humana, inclusive para envenenamento por serpentes e escorpiões. Fragmentos como scFv, diabody, minibody possuem baixa massa molecular, rápida difusão no tecido, estabilidade e são eficazes na neutralização, além de produzidos por diferentes sistemas de expressão. Nesse trabalho foram produzidos fragmentos de anticorpos humanizados que tiverem como template o monoclonal murino anti Loxosceles intermedia, LimAb7. A primeira geração de fragmentos produzidos, scFv15hLi7, manteve o perfil de reconhecimento da molécula de origem; porém, não foi capaz de neutralizar a atividade hemolítica in vitro do veneno. Tendo em vista que, a molécula parental liga-se próximo ao sítio ativo e, dessa forma poderia ocasionar impedimento estérico, foi inserida uma sequência que codifica CH3 a fim de aumentar o tamanho do fragmento. O minibody (scFv15h-CH3Li7) apresentou resultados mais promissores que o formato de scFv, mas manteve-se instável e com baixo rendimento de produção. As análises da sequência da primeira geração por docking sugeriram um deslocamento na interação com o antígeno e, com isso foram realizadas duas mutações reversas dando origem a segunda geração de fragmentos, scFv15hli7m e scFv5hLi7m (diabody). O scFv5hLi7m foi capaz de reconhecer o veneno e neutralizar os efeitos hemolíticos dependente ou não do sistema complemento, mesmo em concentrações altas da toxina; considerado então, promissor no tratamento de loxoscelismo.

Abstract: Poisoning by Loxosceles spp. spiders (loxoscelism) is a public health problem in Brazil, with over 6,000 cases per year. The accident is characterized by dermonecrotic and / or systemic lesions that, if not treated correctly, can lead to serious damage including death. Specific treatment is based on administration of antiloxosceles or antiarachnic serum. Serum production has been described for over a century and, although effective, is a laborious method that has important limitations such as the need for high amounts of crude poisons as immunogens for horses, the use of a large number of animals, and their use may lead to adverse reactions given the heterologous nature of immunoglobulins. Currently, the use of recombinant antibody fragments in therapy in various areas of human health, including snake and scorpion poisoning, has been studied. Fragments such as scFv, diabody, minibody have low molecular mass, fast tissue diffusion, stability and are effective in neutralizing, and produced by different expression systems. In this work humanized antibody fragments having the murine monoclonal anti Loxosceles intermedia, LimAb7 as a template were produced. The first generation of fragments produced, scFv15hLi7, maintained the recognition profile of the source molecule, but was unable to counteract the in vitro hemolytic activity of the venom. Since the parent molecule binds near the active site and could thus cause steric hindrance, a sequence encoding CH3 was inserted to increase fragment size. The minibody (scFv15h- CH3Li7) showed more promising results than the scFv format, but remained unstable and with low yield. First generation sequence analysis by docking suggested a shift in interaction with the antigen, and two reverse mutations were performed, resulting in the second generation of fragments, scFv15hli7m and scFv5hLi7m (diabody). scFv5hLi7m was able to recognize the poison and neutralize the hemolytic effects dependente or not on the complement system, even at high toxin concentrations; considered promising in the treatment of loxoscelism.