Desregulação das vias de autofagia e de NRF2 pelas toxinas urêmicas indoxil sulfato, P- cresil sulfato e ácido indol acético

Abstract

Resumo: Toxinas urêmicas são substâncias de tamanho variável, que acumulam no sangue de pacientes da doença renal crônica (DRC), e em altas concentrações tornam-se tóxicas. Algumas se ligam a proteínas e por isso não são removidas facilmente pela diálise. Destacam-se indoxil sulfato (IxS), p-cresil sulfato (pCS) e ácido indol acético (IAA), as quais, em concentrações elevadas, estão associadas a mortalidade aumentada dos pacientes de DRC. A principal causa de morte desta população são as doenças cardiovasculares. A autofagia é um processo básico de degradação intracelular, e desempenha uma ação crucial no desenvolvimento, e na sobrevivência de todos os tipos celulares. Em situações de estresse, as células ativam o processo autofágico para lidar com o agente estressor, justificando o efeito deletério da autofagia inibida. Na primeira parte deste trabalho, mostramos que IxS, pCS e IAA, isoladamente ou combinadas, inibem o fluxo autofágico celular. Células tumorais epiteliais (HeLa) tratadas por 4h com as toxinas urêmicas apresentaram uma expressão aumentada das proteínas LC3II e p62, indicando um fluxo autofágico inibido. Este dado foi confirmado por ensaio de fluxo autofágico utilizando bafilomicina A1. A inibição foi demonstrada também por imagem. Células NIH3T3 expressando a proteína mRFP-GFP-LC3 foram incubadas por 4h com as toxinas isoladas ou combinadas e analisadas por microscopia confocal. Além disso, investigamos os efeitos da autofagia inibida em células endoteliais EA.hy926. Os dados obtidos mostraram que células endoteliais tratadas por 48 h com as toxinas urêmicas apresentaram aumento nos níveis de proteínas carboniladas e aumento na sensibilidade ao peróxido de hidrogênio, efeitos que foram suprimidos quando as células foram pré-tratadas com rapamicina, um agente ativador da autofagia. Na segunda parte deste trabalho, investigamos o efeito das toxinas urêmicas na via de Nrf2, uma vez que já foi demonstrado que autofagia bloqueada pode ativar Nrf2 pela via não-canônica. Nrf2 é uma proteína presente no citossol celular ligado a proteína Keap1 em condições fisiológicas. Quando as células são expostas a agentes eletrofílicos e oxidantes, Nrf2 é acumulada, transloca para o núcleo e atua como fator de transcrição, ativando a transcrição de genes antioxidantes e de destoxificação. Células HeLa expostas por 4 h às toxinas urêmicas apresentaram um aumento na expressão da proteína Nrf2. Para avaliar se esta ativação era resultado da ativação não canônica, comparamos a ativação do gene repórter luciferase em células expressando Keap1 selvagem ou Keap1 C151S, pois a via não-canônica independe do resíduo de cisteína 151. De fato, nossos resultados mostraram que enquanto os ativadores clássicos de Nrf2 sulforafano ou t-butilhidroquinona só ativaram a luciferase em células com Keap1 selvagem, as toxinas urêmicas combinadas ativaram a luciferase tanto em células com Keap1 selvagem como com Keap1 mutado, indicando que a ativação de Nrf2 promovida pelas toxinas é não canônica. Esta ativação, contudo, é transiente, e após 48 h de exposição, é perdida, como demonstrado pela análise de localização subcelular de Nrf2 por microscopia confocal. Finalmente, usando células MEF NRF2 +/+ ou NRF2?/?, mostramos que a viabilidade celular após 48 h de incubação com as toxinas urêmicas apresentou-se diminuída na ausência de Nrf2, corroborando a ideia do importante papel da via Nrf2 na uremia. Em conjunto, nossos dados mostram que as toxinas urêmicas são capazes de inibir o fluxo autofágico após 4h de tratamento, o que leva a uma ativação transiente, mas seguida de uma inativação da via de Nrf2. Estes dados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de toxicidade urêmica.

Abstract: Uremic toxins are variable-sized substances that accumulate in the blood of patients with chronic kidney disease (CKD), and in high concentrations become toxic. Some of them bind to proteins and are not easily removed by dialysis. These include indoxyl sulfate (IxS), p-cresyl sulfate (pCS) and indole acetic acid (IAA), which, in high concentrations, are associated with increased mortality in patients with CKD. The main cause of death in this population is cardiovascular diseases. Atherogenesis has been associated with deficiency in the autophagy pathway in vascular cells. Autophagy is a basic process of intracellular degradation, and plays a crucial role in the development, and survival of all cell types. In stress situations, the cells activate the autophagic process to deal with the stressor, justifying the deleterious effect of inhibited autophagy. In the first part of this work, we show that IxS, pCS and IAA, alone or in combination, inhibit the autophagic cellular flow. Epithelial tumor cells (HeLa) treated for 4 h with uremic toxins showed increased expression of the LC3II and p62 proteins, indicating an inhibited autophagic flux. This data was confirmed by autophagic flow assay using bafilomycin A1. Inhibition was also demonstrated by imaging. NIH3T3 cells expressing the mRFP-GFPLC3 protein were incubated for 4 h with the toxins isolated or combined and analyzed by confocal microscopy. In addition, we investigated the effects of autophagy inhibited on endothelial cells EA.hy926. The data showed that endothelial cells treated for 48 h with uremic toxins showed increased levels of carbonylated proteins and increased sensitivity to hydrogen peroxide, effects that were suppressed when cells were pretreated with rapamycin, an autophagy activating agent. In the second part of this work, we investigated the effect of uremic toxins on the Nrf2 pathway, since it has already been demonstrated that blocked autophagy can activate Nrf2 by the noncanonical pathway. Nrf2 is a protein present in the cellular cytosol bound to Keap1 protein under physiological conditions. When cells are exposed to electrophilic and oxidizing agents, Nrf2 is accumulated, translocates to the nucleus and acts as a transcription factor, activating the transcription of antioxidant and detoxification genes. Hela cells exposed for 4 h to uremic toxins showed an increase in Nrf2 protein expression. To evaluate whether this activation was a result of non-canonical activation, we compared the activation of the luciferase reporter gene in cells expressing wild Keap1 or Keap1 C151S, since the noncanonical pathway is independent of the cysteine residue 151. Indeed, our results showed that while the classical activators of Nrf2, sulforaphane or t-butylhydroquinone, only activated luciferase in cells with wild Keap1, the combined uremic toxins activated luciferase in both wild-type Keap1 and mutated Keap1 cells, indicating that activation of Nrf2 promoted by toxins is noncanonical. This activation, however, is transient, and after 48 h of exposure, is lost, as demonstrated by the subcellular localization analysis of Nrf2 by confocal microscopy. Finally, using MEF NRF2+ / + or NRF2- / - cells, we showed that cell viability after 48 h of incubation with uremic toxins was decreased in the absence of Nrf2, corroborating the idea of the important role of the Nrf2 pathway in uremia. Taken together, our data show that uremic toxins are able to inhibit autophagic flow after 4h of treatment, which leads to transient activation, but followed by an inactivation of the Nrf2 pathway. These data may contribute to the understanding of uremic toxicity mechanisms.