Efeitos distintos do peróxido de hidrogênio e do superóxido na migração e proliferação de células musculares lisas induzidas pela QSOX1b

Abstract

Resumo: A migração e a proliferação de células musculares lisas vasculares (VSMC) possuem importante papel na hiperplasia da camada íntima arterial em resposta a estímulos patológicos, como a restenose, que consiste na reobstrução do lúmen do vaso sanguíneo após a técnica da angioplastia por cateter balão. Estudos vêm associando a regulação de processos migratórios e proliferativos celulares com moléculas oxidantes, estabelecendo espécies reativas de oxigênio (ROS) como importantes sinalizadores nesse processo. Tiol proteínas estão cada vez mais evidentes na sinalização redox, inclusive a proteína QSOX1 (quiescina sulfidril oxidase), uma tiol oxidase dependente de FAD (flavina adenina dinucleotídeo) que catalisa a oxidação de di(tióis) à dissulfeto, com a redução concomitante do oxigênio molecular (O2) à peróxido de hidrogênio (H2O2). Recentemente, nosso grupo demonstrou que a QSOX1 extracelular está envolvida na proliferação e na migração de VSMC. Desta forma, o objetivo do trabalho foi melhor compreender os mecanismos pelos quais a proteína QSOX1 extracelular está envolvida nos processos de migração e proliferação em VSMC. O modelo experimental consistiu basicamente em VSMC primárias, mas em alguns ensaios foram utilizadas linhagens de células vasculares. Foram utilizadas construções da isoforma curta da proteína QSOX1: wild type (mQSOX) e a mutante inativa (C452SQSOX). A atividade sulfidril oxidase foi determinada pela formação de peróxido de hidrogênio. Os ensaios de migração foram realizados pelos métodos de scratch ou transwell e os ensaios de proliferação por cristal violeta, ambos na presença das proteínas recombinantes e de inibidores e/ou ativadores da produção de ROS. Ensaios de western blotting foram realizados para investigar a via de sinalização envolvida na migração em VSMC induzida pela QSOX1. Nossos resultados mostraram que a proteína QSOX1 recombinante extracelular estimula a migração em VSMC através de processos que envolvem aumento da produção de ROS. A presença do H2O2 resultante da atividade sulfidril oxidase e a presença do complexo enzimático NADPH oxidase (especificamente NOX1) mostraram-se importantes no processo migratório induzido pela QSOX1. A ausência da QSOX1 endógena inibe a motilidade de células musculares lisas. Além disso, a atividade desta enzima mostrou estar associada à regulação da via SSH1-cofilina, indicando ser a proteína QSOX1 uma reguladora redox que contribui para reorganização do citoesqueleto de actina durante o movimento celular. Foi também demonstrado que em concentrações mais altas e um tempo maior de exposição a proteína QSOX1 recombinante extracelular induz proliferação de VSMC. Este processo também foi dependente de ROS, especificamente com a formação de ânion superóxido (O2 o-). Em resumo, nossos dados indicam o envolvimento da QSOX1 recombinante extracelular na sinalização dos processos de migração de proliferação de VSMC mediados por NOX1. Palavras-chave: Migração. Proliferação. QSOX1. ROS. NOX1.

Abstract: Vascular smooth muscle cell (VSMC) migration and proliferation plays an important role in arterial intima layer hyperplasia in pathological responses, like restenosis, which consists in reobstruction of the blood vessel lumen after the balloon catheter angioplasty technique. Studies have been associating the regulation of cell migratory and proliferative processes with oxidizing molecules, establishing reactive oxygen species (ROS) as relevant messengers in these events. Thiol proteins are increasingly evident in redox signaling, including QSOX1 protein (quiescin sulfhydryl oxidase), FAD (adenine dinucleotide flavin) - dependent thiol oxidase that catalyzes the oxidation of di (thiols) to disulfide, concomitant reduction of molecular oxygen (O2) to hydrogen peroxide (H2O2). Our group recently demonstrated that extracellular QSOX1 is involved in VSMC proliferation and migration. Thus, the purpose of the study was to better understand the mechanisms by which extracellular QSOX1 protein is involved in the migration and proliferation processes in VSMC. The experimental model consisted of primary VSMC, but in some trials vascular cell line were used. Constructs of the short protein isoform QSOX1: wild type (mQSOX) and the inactive mutant (C452SQSOX) were used. Sulfhydryl oxidase activity was determined by the formation of hydrogen peroxide. Migration assays were performed by scratch or transwell methods and proliferation assays by crystal violet, both in the presence of recombinant proteins and ROS production inhibitors and/or activators. Western blotting assays were performed to investigate the signaling pathway involved in QSOX1-induced VSMC migration. Our results showed that extracellular recombinant QSOX1 protein stimulates migration in VSMC through processes involving increased ROS production. The presence of H2O2 resulting from sulfhydryl oxidase activity and the presence of the enzyme complex NAPH oxidase (specifically NOX1) proved to be important in the QSOX1 induced migration process. The absence of endogenous QSOX1 inhibits smooth muscle cell motility. In addition, the activity of this enzyme has been shown to be associated with regulation of the SSH1-cofillin pathway, indicating that QSOX1 protein is a redox regulator that contributes to actin cytoskeleton reorganization during cell movement. It has also been shown that at higher concentrations and longer exposure time to extracellular recombinant QSOX1 protein induces VSMC proliferation. This process was also ROS dependente, specifically through the formation of superoxide (O2 o-). In summary, our data indicate the involvement of extracellular recombinant QSOX1 in signaling NOX1-mediated VSMC proliferation migration processes. Key-words: Migration. Proliferation. QSOX1. ROS. NOX1