Produção e avaliação de hialuronidase do veneno de aranha marrom : busca por aplicações biotecnológicas e soluções terapêuticas

Abstract

Resumo: Hialuronidases são enzimas que medeiam a degradação do ácido hiaiurônico (AH), aumentam a permeabilidade de tecidos conjuntivos e decrescem a viscosidade dos fluidos corporais. São comuns em venenos animais, estando presentes no veneno de aranhas do gênero Loxoceles, e referidas como um "fator de espalhamento" das demais toxinas. Anteriormente, uma isoforma de hialuronidase recombinante de Loxosceles intermedia (DHAase, Dietrich's hyaluronidase) foi produzida em sistema de expressão procarioto como uma proteína recombinante insolúvel necessitando de processo de redobramento in vitro para sua solubilização e atividade. A utilização de modelos de expressão baseados em células de inseto foi a abordagem escolhida neste trabalho como um método alternativo de expressão dessa enzima capaz de estabelecer modificações póstraducionais e produzir uma proteína recombinante com características semelhantes à enzima nativa. O trabalho descreve a obtenção e purificação bemsucedida de uma isoforma de hialuronidase recombinante de L. intermedia em sistema eucarioto, ativa e possivelmente mais próxima a conformação nativa que a isoforma produzida em sistema procarioto. Os processos de purificação e ímunodetecção foram demonstrados em ensaios de SDS-PAGE e Western blotting e a comprovação da produção da enzima ativa foi demonstrada em ensaios de degradação de agarose, zimografia e turbidimetria. A função da enzima como "fator de espalhamento" no veneno de L. intermedia foi confirmada por meio de ensaios de dermonecrose experimental em coelhos e de permeabilidade vascular em camundongos. Em ambos testes biológicos a enzima mostrou aumentar a área de ação da fosfolipase-D recombinante. Como fatores de espalhamento, as hialuronidases têm um papel relevante no desenvolvimento dos sintomas após os acidentes e, por isso, há uma busca por moléculas que inibam a atividade dessas enzimas. A N-acetilcisteína (NAC) é uma molécula amplamente utilizada na clínica com seu uso aprovado há mais de 30 anos e estudos farmacocinéticos, farmacodinâmicos e de toxicidade bem estabelecidos. Sua ação inibitória sobre rnetaloproteases e hialuronidases tem sido demonstrada. A inibição da hialuronidases e rnetaloproteases de venenos loxoscélicos pela N-acetil cisteína (NAC) foi demonstrada através de ensaios de turbidimetria e zimograma. Assim, pela primeira vez uma hialuronidase de veneno de Loxosceles foi produzida por sistema de expressão eucarioto. Essa enzima recombinante - LiHyal2 - é uma bioferramenta importante com características muitos semelhantes à hialuronidase nativa e deve continuar a auxiliar na elucidação dos mecanismos do loxoscelismo. A inibição da sua atividade enzimática pela N-acetilcisteína também demonstra a importância da LiHyal2 na busca por uma terapia específica para os pacientes picados por estas aranhas. PALAVRAS-CHAVES: HIALURONIDASE; LOXOSCELES; CÉLULAS Sf9.

Abstract: Hyaluronidases are a group of enzymes that mediate the degradation of hyaluronic acid (HA), increase the permeability of connective tissues and decrease the viscosity of body fluids. They are common in animal venoms. They are present in the Loxoceles spider venom and known as "spreading factors" of the other toxins. Previously, a recombinant hyaluronidase isoform of Loxoceles intermedia (DHAase, Dietrich's hyaluronidase) was produced in a prokaryotic expression system as an insoluble recombinant protein, requiring in vitro refolding for its solubilization and activity. The use of expression models based on insect cells was the approach used in this work, as an alternative method of expression of this enzyme. Eukaryotic systems can perform post-translational modifications and produce a recombinant protein with characteristics closer to the native enzyme. The data show the obtaining and successful purification of a recombinant hyaluronidase isoform of L. intermedia in eukaryotic system, in its active form and possibly closer to its native conformation than was the isoform previously produced in prokaryotic system. The purification and immunodetection processes were demonstrated in SDS-PAGE and Western blotting assays and the evidence of active enzyme production was demonstrated by hyaluronic acid degradation visualized by agarose gel, zymography and turbidimetry assays. The function of the enzyme as a "spreading factor" in the L. intermedia venom was confirmed through experimental dermonecrosis in rabbits and vascular permeability in mice. In both biological tests, the enzyme was able to increase the dermonecrosis area produced by recombinant phospholipase-D and increased the vascular permeability. As spreading factors, hyaluronidases have a relevant role in the development of symptoms after accidents and, therefore, there is a search for hyaluronidase inhibitors. N-acetylcysteine (NAC) is a molecule widely used in the clinic and its use is approved for over 30 years with well-established pharmacokinetic, pharmacodynamic and toxicity studies. Its inhibitory action against metalloproteases and hyaluronidases has been demonstrated. The inhibition of hyaluronidases and metalloproteases of Loxosceles venoms by N-acetyl cysteine (NAC) was demonstrated through turbidimetry and zymogram tests. Thus, for the first time a hyaluronidase from Loxosceles venom was produced in a eukaryotic expression system. This recombinant enzyme - LiHyal2 - is an important biotool with very similar characteristics to native hyaluronidases and should continue to help elucidate the mechanisms of loxoscelism. The inhibition of its enzymatic activity by N-acetylcysteine also demonstrates the importance of LiHyal2 in the search for a specific therapy for victims of these spiders. KEY WORDS: HYALURONIDASE; LOXOSCELES; Sf9 CELLS