Taxonomia, atividade antimicrobiana e antitumoral de isolados endofíticos de Diaporthe spp.

Abstract

Resumo: Os fungos endofíticos representam uma reserva inexplorada de estruturas químicas, geradas por relações coevolutivas entre microrganismo e hospedeiro. Há uma grande chance de encontrar novos metabólitos secundários com atividade biológica nesses fungos. O gênero Diaporthe (sin. Phomopsis) tem se destacado nesse contexto, pois é geralmente encontrado em associação como endofítico e por sua alta capacidade de sintetizar uma ampla gama de metabólitos secundários incluindo os policetídeos. Tais características fazem do gênero um candidato promissor na produção de substâncias com aplicabilidade na indústria farmacêutica e na agricultura. Os objetivos desta pesquisa foram caracterizar morfológica e molecularmente isolados de Diaporthe spp., obtidos em sementes de peroba rosa (Aspidosperma polyneuron Muell. Arg.), visando sua identificação específica, e avaliar a sua atividade antimicrobiana e antitumoral. Os fungos foram selecionados na coleção de fungos e oomicetos florestais, da Embrapa Florestas, e tiveram seu crescimento avaliado nos meios batata dextrose ágar (BDA), extrato de malte ágar (MEA) e aveia ágar (OA) para caracterização morfológica. Em seguida foram sequenciadas cinco regiões, calmodulina (CAL), histona (HIS), beta tubulina (TUB), fator de elongação (TEF1) e região interespaçadora (ITS). Com base na caracterização morfológica e análise filogenética multilocus duas novas espécies endofíticas de Diaporthe, isoladas de sementes de peroba rosa são descritas e propostas. Morfologicamente, Diaporthe sp. 1 é caracterizado por alfa conídios hialinos, sem septo, lisos, oblongo a elipsóides (7 - 8 × 3 ?m) e beta conídios hialinos, sem septo, reto a curvos, 23 - 30 × 2 ?m. Diaporthe sp. 2 é caracterizada por alfa conídios hialinos, sem septo, fusiforme (8 - 10 × 3 ?m) e beta conídios hialinos, sem septo, reto a curvados, 25 - 29 × 2 ?m. Nove isolados de Diaporthe spp. foram avaliados quanto a produção de metabólitos secundários e atividade antimicrobiana e antitumoral. Para isso, foi verificada a expressão do Domínio Policetídeo Sintase (PKS), sugerida as classes dos compostos produzidos por cromatografia de camada delgada (CCD), e avaliada a atividade biológica frente a linhagens de fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum, Fusarium pseudocircinatum, Colletotrichum spp. e Phytophthora palmivora; a levedura Candida albicans, as bactérias Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e Enterococcus faecalis; e linhagens celulares H295R (Carcinoma Adrenocortical) e HEK293T (Embrionária de rim). Foi confirmada a presença de policetídeos não reduzidos (NR-PKS) em todos os isolados, bem como a produção de alcaloides, terpenoides e compostos fenólicos. Houve inibição dos fungos fitopatogêncios F. oxysporum, F. pseudocircinatum, Colletotrichum spp. e P. palmivora. Foi verificada atividade dos extratos inibindo E. faecalis, P. aeruginosa, K. pneumoniae e a levedura C. albicans. As frações dos extratos avaliados como antitumorais reduziram a viabilidade celular da linhagem H295R em 35.7%. Os resultados desta pesquisa revelam duas novas espécies de Diaporthe com potencial para o controle biológico de fungos fitopatogênicos e bactérias e levedura humano patogênicas. Além disso, o estudo sugere ação antitumoral dos extratos e classes de compostos com possível aplicação biotecnológica. No entanto, mais testes precisam ser realizados para otimização da produção de metabólitos secundários, confirmação dos compostos produzidos e isolamento das moléculas de interesse. Palavras-chave: Diaporthaceae, endófitos, bioprospecção, metabólitos secundários, espécie florestal nativa

Abstract: Endophytic fungi represent an unexplored reserve of chemical structures, generated by coevolutionary relationships between microorganism and host. There is a great chance of finding new secondary metabolites with biological activity in these fungi. The genus Diaporthe (syn. Phomopsis) has stood out in this context, as it is generally found in association as endophytic and for its high capacity to synthesize a wide range of secondary metabolites including polyketides. Such characteristics make the genus a promising candidate in the production of substances with applicability in the pharmaceutical industry and in agriculture. The objectives of this research were to characterize morphologically and molecularly isolated Diaporthe spp., Obtained from "peroba rosa" seeds (Aspidosperma polyneuron Muell. Arg.), aiming at their specific identification, and to evaluate their antimicrobial and antitumor activity. The fungi were selected from the collection of forest fungi and oomycetes, from Embrapa Florestas, and subjected to growth in potato dextrose agar (PDA), malt extract agar (MEA) and oat agar (OA) for morphological characterization. Then five regions were sequenced, calmodulin (CAL), histone (HIS), beta tubulin (TUB), elongation factor (TEF1) and interspace region (ITS). Based on the morphological characterization and multilocus phylogenetic analysis two new species of Diaporthe, isolated from "peroba rosa" seeds are described and proposed. Morphologically, Diaporthe sp. 1 is characterized by hyaline alpha conidia, without septum, oblong to ellipsoid (7 - 8 × 3 ?m) and hyaline beta conidia, without septum, straight to curved, 23 - 30 × 2 ?m. Diaporthe sp. 2 is characterized by hyaline alpha conidia, without septum, fusiform (8 - 10 × 3 ?m) and hyaline beta conidia, without septum, straight to curved, 25 - 29 × 2 ?m. Nine isolates of Diaporthe spp. were evaluated for the production of secondary metabolites and antimicrobial and antitumor activity. For this, the expression of the Polyketide Domain Synthase (PKS) was verified, the classes of compounds produced by thin layer chromatography (CCD) were suggested, and the biological activity was evaluated against strains of phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum, Fusarium pseudocircinatum, Colletotrichum spp. and Phytophthora palmivora; the yeast Candida albicans, the bacteria Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes and Enterococcus faecalis; and H295R (Adrenocortical Carcinoma) and HEK293T (Kidney Embryonic) cell lines. The presence of non-reduced polyketides (NR-PKS) was confirmed in all isolates, as well as the production of alkaloids, terpenoids and phenolic compounds. There was activity against phytopathogenic fungi F. oxysporum, F. pseudocircinatum, Colletotrichum spp. and P. palmivora. Extract activity was verified, inhibiting E. faecalis, P. aeruginosa, K. pneumoniae and the yeast C. albicans. The fractions of the extracts evaluated as antitumoral reduced the cell viability of the H295R strain by 35.7%. The results of this research reveal two new species of Diaporthe with potential for biological control of phytopathogenic fungi and pathogenic human bacteria and yeast. In addition, the study suggests antitumoral action of extracts and classes of compounds with possible biotechnological application. However, more tests need to be carried out to optimize the production of secondary metabolites, confirmation of the compounds produced and isolation of the molecules of interest. Keywords: Diaporthaceae, endophytes, bioprospecting, secondary metabolites, native forest species