Estudo do controle traducional da expressão gênica em Trypanossoma cruzi

Abstract

Resumo: Nas células eucarióticas, os mRNAs podem estar compartimentalizados em ribonucleoproteínas mensageiras (mRNPs) que são classificadas em função da presença de proteínas específicas e do destino dos mRNAs nas células. Dentre essas estruturas estão os complexos de iniciação da tradução e os grânulos de mRNPs. Os complexos de iniciação da tradução são formados pelas proteínas eIFs (eukaryotic initiation factors) dos quais destaca-se o complexo eIF4F, formado por eIF4A, eIF4E e eIF4G. eIF4E interage diretamente com o cap do mRNA e presume-se que a formação de eIF4F é, em grande parte, regulada pela disponibilidade de eIF4E. Dentre os grânulos de mRNPs mais estudados estão os Processing bodies (P-bodies) e os grânulos de estresse (GE). De forma geral, os GE são definidos pela presença de alguns fatores de iniciação da tradução enquanto os P-bodies são definidos pela presença de componentes da maquinaria de degradação. Estudos em eucariotos têm revelado que os complexos de início de tradução podem interagir com os grânulos e trocar diferentes ribonucleoproteínas mensageiras. Esta interação sugere um ciclo citoplasmático dinâmico com o intercâmbio de mRNAs entre tradução, GE e P-bodies. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo estudar a regulação da expressão gênica do Trypanosoma cruzi em nível pós-transcricional, iniciado o estudo dos seis homólogos do fator de iniciação da tradução EIF4E (EIF4E1-EIF4E6) de T. cruzi, buscando identificar os parceiros funcionais de cada fator. Paralelamente, caracterizamos os mRNAs totais no citoplasma, os mRNAs associados aos complexos ribonucleoproteicos que contém as proteínas TcXRNA e TcDHH1 e os mRNAs associados aos polissomos nas formas epimastigotas em crescimento exponencial e nas formas epimastigotas submetidas a estresse nutricional. Através deste trabalho foi possível verificar que o T. cruzi, assim como os demais tripanossomatídeos, apresenta uma grande multiplicidade de homólogos para os fatores de início de tradução que compõe o complexo eIF4F. A fim de identificar as interações que ocorrem entre estes fatores, realizamos ensaios de duplo-híbrido, imunoprecipitação e co-imunolocalização e identificamos três novas interações que ainda não foram relatadas em nenhum outro tripanossomatídeo, EIF4E3:PABP1, EIF4E3:PABP2 e EIF4E5:EIF4G5. Os fatores TcEIF4E5 e TcEIF4G5 co-localizam em parasitas epimastigotas, principalmente na periferia do núcleo. Além disso, reforçamos a ideia de que o controle da expressão gênica em tripanossomatídeos ocorre predominantemente em nível pós-transcricional, pois ao comparar o transcriptoma de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional não foram identificadas diferenças significativas na expressão de genes em nível de mRNA. Verificamos também que ocorre a redução da tradução quando o parasita é submetido ao estresse nutricional, indicando que o parasita pode modular a expressão de seus genes em nível traducional. O sequenciamento dos mRNAs associados a complexos contendo as proteínas TcXRNA e TcDHH1 mostrou que essas proteínas interagem com diferentes mRNAs, e que ambas as proteínas associam-se tanto à mRNAs que também estão presentes em complexos polissimais, quanto mRNAs que podem estar traducionalmente reprimidos. Dessa maneira, esses dados sugerem que essas proteínas possam participar de complexos ribonucleoproteicos distintos os quais são importantes para regulação da expressão gênica de T. cruzi. Os resultados obtidos neste trabalho, abrem novas perspectivas para o entendimento da função de cada complexo de início de tradução eIF4F-like no ciclo do mRNA em T. cruzi. Além disso, todos esses dados, reforçam a importância da regulação da expressão gênica em nível de tradução, e fornece novas evidências a respeito da dinâmica dos mRNAs e da disponibilidade dos EIF4Es neste organismo. Palavras-chaves: ciclo de mRNA; tradução; eIF4E; P-bodies; grânulos de estresse.

Abstract: In eukaryotic cells, mRNAs can be compartmentalized into messenger ribonucleoproteins (mRNPs) that are classified according to the presence of specific proteins and the fate of mRNAs in cells. Among these structures are translation initiation complexes and mRNP granules. The translation initiation complexes are formed by the eIFs proteins (eukaryotic initiation factors) of which the eIF4F complex, formed by eIF4A, eIF4E and eIF4G stands out. eIF4E interacts directly with the mRNA cap and it is assumed that the formation of eIF4F is largely regulated by the availability of eIF4E. Among the most studied mRNP granules are Processing bodies (P-bodies) and stress granules (GE). In general, GE are defined by the presence of some translation initiation factors while P-bodies are defined by the presence of components of the degradation machinery. Studies in eukaryotes have revealed that translation initiation complexes can interact with granules and exchange different messenger ribonucleoproteins. This interaction suggests a dynamic cytoplasmic cycle with the exchange of mRNAs between translation, GE and P-bodies. Thus, the present study aimed to study the regulation of the gene expression of Trypanosoma cruzi at the post-transcriptional level, beginning the study of the six homologues of the translation initiation factor EIF4E (EIF4E1-EIF4E6) of T. cruzi, seeking to identify the functional partners of each factor. In parallel, we characterize the total mRNAs in the cytoplasm, the mRNAs associated with the ribonucleoprotein complexes that contain the TcXRNA and TcDHH1 proteins and the mRNAs associated with the polysomes in exponentially growing epimastigotes and epimastigote forms subjected to nutritional stress. Through this work it was possible to verify that T. cruzi, like the other trypanosomatids, has a large multiplicity of homologues for the translation initiation factors that make up the eIF4F complex. In order to identify the interactions that occur between these factors, we performed two-hybrid, immunoprecipitation and co-immunolocation assays and identified three new interactions that have not yet been reported in any other trypanosomatids, EIF4E3: PABP1, EIF4E3: PABP2 and EIF4E5: EIF4G5. The factors TcEIF4E5 and TcEIF4G5 co-localize in epimastigote parasites, mainly in the periphery of the nucleus. In addition, we reinforce the idea that the control of gene expression in trypanosomatids occurs predominantly at the post-transcriptional level, since when comparing the transcriptome of epimastigotes and epimastigotes under nutritional stress, no significant differences were found in the expression of genes at the mRNA level. We also found that there is a reduction in translation when the parasite is subjected to nutritional stress, indicating that the parasite can modulate the expression of its genes at the translational level. The sequencing of mRNAs associated with complexes containing the TcXRNA and TcDHH1 proteins showed that these proteins interact with different mRNAs, and that both proteins are associated with both mRNAs that are also present in polysimal complexes, and mRNAs that may be translationally repressed. Thus, these data suggest that these proteins may participate in different ribonucleoprotein complexes, which are important for the regulation of T. cruzi gene expression. The results obtained in this work open new perspectives for the understanding of the function of each complex of eIF4F-like translation initiation in the mRNA cycle in T. cruzi. In addition, all of these data reinforce the importance of regulating gene expression at the translation level, and provide new evidence regarding the dynamics of mRNAs and the availability of EIF4Es in this organism. Keywords: mRNA cycle; Translation; eIF4E; P-bodies; stress granules.